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溶藻弧菌是一种分布广泛的海洋病原菌,生长速度快的特点使其在环境中能够占据优势生态位。溶藻弧菌能够感染包括鱼类、甲壳类、珊瑚虫在内的多种海洋动物,对全球的水产养殖业造成严重损失。包括溶藻弧菌在内的细菌通常使用一些独特的分泌系统适应其所在的环境。Ⅵ型分泌系统(T6SS)正是这样一种广泛存在于革兰氏阴性菌中的毒力分泌系统。这种多组分的分泌系统介导针对宿主的毒力,也介导细菌之间的竞争。溶藻弧菌EPGS编码了两套T6SS(T6SS1和T6SS2),这两套T6SS均含有完整的13个T6SS核心组件。目前对这两套T6SS的功能知之甚少。我们探索了溶藻弧菌EPGS在平板状态下发挥最优杀菌能力的条件,发现溶藻弧菌的毒力不局限于大肠杆菌,对其他多种海洋细菌都有显著的杀伤作用。共聚焦显微镜和杀菌实验表明,在平板状态下,溶藻弧菌EPGS进行细菌竞争主要依赖于T6SS2,而非T6SS1。qRT-PCR和Western blot数据发现,T6SS2所介导的杀菌活力受到群体感应系统(QS)和磷酸激酶PpkA2的调控。我们采用磷酸化蛋白质谱的筛选方法,鉴定与T6SS2活力相关并依赖于PpkA2的磷酸化底物。与其他细菌一样,PpkA2的自磷酸化对T6SS2的功能至关重要。另一个鉴定到的T6SS2基因簇内蛋白是DotU2,它的两个苏氨酸位点都可以被PpkA2磷酸化,这两个磷酸化位点对p-DotU2是冗余的。p-DotU2能与Fha2结合,激活T6SS2的分泌。处于T6SS2基因簇外的小蛋白VtsR也能被PpkA2磷酸化。这个蛋白通过调控QS中枢元件LuxR的表达,对T6SS2的表达产生重要的影响。在溶藻弧菌EPGS中,PpkA2通过控制一系列的磷酸化蛋白底物介导了 T6SS和QS之间的正反馈通路,提高溶藻弧菌的竞争能力。除了激酶PpkA2,溶藻弧菌EPGS的T6SS2基因簇内,还编码一个隶属于PP2C磷酸酶家族的蛋白PppA。在之前的研究中,PP2C家族磷酸酶主要响应压力应激。PppA-PpkA也能调控其他一些非T6SS的表型。目前,在溶藻弧菌T6SS中PppA扮演的角色还不明确。通过磷酸化质谱的筛选,我们发现PppA的第253位苏氨酸能被PpkA2磷酸化,同时PppA的磷酸酶活性会受到PpkA2调控。在平板状态下,p-PppA调控T6SS2的表达和活力。实验数据进一步表明,PppA蛋白和其磷酸化位点通过LuxR调控T6SS2的活性。本实验室之前的数据表明,在液体环境中,PppA正调控LuxR的表达,因子RpoE直接结合在LuxR的启动子上。通过qRT-PCR,我们发现PppA在转录水平正调控luxR和rpoE。借助Tn-seq技术,尝试寻找了与调控有关的基因。通过Tn-seq的数据,发现了一些可能与PppA调控luxR和rpoE相关的转录调控因子和QS相关基因。同时也发现了一些可能与PppA无关,仅仅是LuxR或RpoE的调控因子。