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海藻糖普遍存在于自然界,是一种非还原性二糖。海藻糖酶可以将海藻糖特异性地水解为葡萄糖,海藻糖酶作为食品添加剂可以治疗二糖缺乏症,人体内某些肾脏疾病的诊断可以通过检测尿海藻糖酶的活性来实现,故而海藻糖酶在食品、医疗等领域具有很高的应用价值,此外,也可以通过研究海藻糖酶的结构与功能开发新型酶抑制剂应用于昆虫防治中。本研究从阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae strain AR0002）中克隆到了一个海藻糖酶基因,将其命名为treE。treE基因全长1650bp,GC含量58%,编码549个氨基酸,分子量为63.5kDa,预测的pI为4.93。与NCBI数据库中的海藻糖酶基因序列对比后发现,treE与来自于Enterobacter Cloacae ATCC 13047的海藻糖酶基因序列具有88%的一致性。酶学性质分析表明,treE的最适反应温度和pH分别为50℃和6.0。在pH5.5-9.0的范围内,酶在4℃条件下处理了48h,保持了80%以上的活性,说明在偏中性的条件下,该酶的稳定性良好。Mn2+,Fe3+（1mM,5mM）,Co2+（1mM）可以提高treE的活性,Cu2+,Fe3+（10mM）,Mg2+（10mM）,Co2+（10mM）抑制了treE的活性。最适条件下,treE的Km是3.318 mmol/L,Vmax是0.445 mmol/L?min,kcat是1265.164s-1,催化效率（kcat/Km）为381.303 L?mmol-1?s-1。为了提高treE的催化活性,对treE进行了体外诱变,构建了随机突变文库,利用实验室建立的高通量筛选方法,我们从16000个随机突变体中筛选获得了一个酶活提高突变子1-D8。序列分析表明,1-D8含有两个突变位点:Tyr22Cys和Trp491Arg。酶学性质分析表明,1-D8的最适反应温度为45℃,比野生型降低了5℃;最适反应pH为6.5,用pH5.5-9.0的缓冲液在4℃下处理48h后,仍保留80%以上的活性。动力学分析表明,1-D8的Km是3.082 mmol/L,kcat值为1819.651 s-1,kcat/Km值为590.412 L?mmol-1?s-1,比野生型提高了54.8%。为了探究1-D8中两个突变位点对酶活的影响,本研究依次对它们进行了单点回复突变。酶动力学分析表明,Y22C的Km是3.355mmol/L,kcat为1331.910 s-1,催化效率（kcat/Km）为396.993 L?mmol-1?s-1,比野生型提高了4.0%。突变体W491R的Km值为3.060mmol/L,kcat值为1734.137s-1,催化效率（kcat/Km）为566.711 L?mmol-1?s-1,比野生型高了48.6%。这表明1-D8活性的提高主要来自突变位点W491R的贡献。此外,本研究通过结构模拟与分子对接,初步确定R168可能与treE的催化效率有关。为了验证这一推测,我们构建了单点突变R168G,其Km为2.380mmol/L,kcat为530.777 s-1,催化效率（kcat/Km）为223.016L?mmol-1?s-1,与野生型相比下降了41.5%。本研究在获得海藻糖酶的基础上,对其进行定向改良,获得了酶活提高的突变体,为进一步改造提高酶活提供了材料和线索。同时,鉴定了与催化效率相关的氨基酸残基,为深入探索海藻糖酶结构与功能关系提供了参考。