伪狂犬病病毒(Pseudorbies virus, PRV)属疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科中的猪疱疹病毒I型,它能导致多种家畜和野生动物发生急性传染病。猪是该病毒的贮存者和传染源,猪感染PRV后常表现为神经系统的功能紊乱和呼吸系统疾病并引起严重的繁殖障碍。该病已给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失,预防、控制并最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。采用安全有效的疫苗进行免疫预防,是控制该病的主要措施。本试验旨在构建含(GFP)报告基因的伪狂犬病病毒gG基因缺失表达载体。通过酶切、补平、连接的方法对PUSK载体质粒进行改造,消除了该载体上的BamHI和HindIII两酶切位点。并将改造后的PUSK命名为PUSBH。根据pAcGFP1-C1基因序列设计一对引物,分别在引物的上、下游5’端引入了NotI酶切位点,通过PCR扩增将目的基因AcGFP(包括GFP、CMV、MCS、SV40 Poly(A))克隆入pGEM-T-Easy载体内,构建了重组质粒。经酶切和PCR鉴定证明插入片段是AcGFP基因,并将重组质粒命名为pT-GFP。用NotI酶切重组质粒pT-GFP和载体PUSBH并回收,将载体去磷酸化后与目的片段AcGFP链接,通过PCR扩增、酶切、序列测定证明,该转移载体构建成功。并将其命名为PUSG。该转移载体含有四个单一酶切位点可供外源基因的插入,从而为构建以伪狂犬病毒作载体的二价或多价基因工程疫苗打下了基础。利用脂质体介导的方法,将转移载体质粒PUSG与PRV基因组DNA共转染PK-15细胞。于荧光显微镜下48h便能观察到绿色荧光,用吸管将有荧光的病变细胞吸出,经过三次连续传代得到了纯化病毒。并经过PCR和酶切鉴定重组病毒构建成功。重组病毒的获得为下一步研制二价或多价疫苗的筛选提供了方便。