研究背景和目的：结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的恶性肿瘤之一。手术切除是结直肠癌的一个主要治疗方式,然而临床上有一半以上的结直肠癌患者在行根治性手术前已出现了微转移,50%术后患者发生肝转移,是患者死亡的主要原因。即使Ⅱ期～Ⅲ期直肠癌根治术后局部区域复发率为15～65%,行全直肠系膜切除术,Ⅲ期患者的局部复发率仍高达20～30%。为提高局部控制率和远期生存率,这部分患者应该同时进行标准的直肠癌辅助治疗。放疗抵抗是肿瘤患者放疗治疗失败的主要原因,不同个体展示对放疗治疗反应的明显差异。放疗抵抗导致患者不但对治疗毫无反应,而且可能会错过肿瘤治疗的最佳时机,因此寻找有效治疗靶点,增强肿瘤放疗敏感性及降低放疗抵抗,是放疗治疗的一个关键。microRNA (miRNA)是一类长约17-25核苷酸(nucleotide, nt)的非编码的小RNA。与靶基因的高度互补结合而降解mRNA或抑制其翻译,改变基因的表达,与动植物的组织器官发育、细胞分化和凋亡、脂肪代谢等生命活动密切相关,其异常表达将导致重大疾病,例如肿瘤的发生。miRNA的表达水平在许多肿瘤中发生改变,起到原癌基因和抑癌基因的作用。综合最近研究发现miRNA和肿瘤的发生、发展、转移以及临床治疗、预后密切相关。到目前为止研究发现很多miRNA和肿瘤放疗治疗的敏感性改变密切相关。Lin28-let7能够通过激活K-Ras基因来重塑肿瘤的放疗敏感性。miR-9和let-7g通过抑制NFkappaBl增强放疗敏感性。在恶性胶质母细胞瘤U87MG细胞中MicroRNA-181a通过靶向调控Bcl-2改变肿瘤细胞的放疗敏感性。同样在体内外实验证实miR-101通过改变DNA-PKcs和ATM的蛋白表达水平来影响肿瘤放疗疗效。具有放疗抵抗的肿瘤细胞亚群具有很多独特的生物学特性,如上皮间质化(epithelial-mesenchymal transition),肿瘤细胞“干细胞特性”。肿瘤中具有干细胞特质的细胞,称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞具有许多独特表型,譬如强大的增殖能力,高度的自我更新和多向的分化潜能,多种药物泵分子的存在,极强的DNA修复能力以及对外界毒素的解毒能力。这可能与对现行治疗的耐受以及治疗抵抗密切相关。由于对抗肿瘤治疗具有原发性或者获得性耐受和抵抗,肿瘤干细胞在治疗后存活下来,并成为复发的一个根源。了解上述肿瘤干细胞特性背后的分子机制,并设计针对肿瘤干细胞的分子靶向治疗,能够极大提高针对肿瘤发生、转移、侵袭以及放化疗抵抗的效果。miR-106b在许多常见肿瘤有异常表达,并在肿瘤的发生、发展转移中发挥重要的作用。在乳腺癌中发现miR-106b能够靶向同样研究SMAD7增强肿瘤细胞“干细胞特性”,从而促进肿瘤转移。肿瘤表明miR-106b和神经细胞的“干细胞特性”是密切相关的。Jamie O. Brett和他的同事研究发现能通过调控insulin/IGF-FoxO信号通路来调节神经干细胞的分化。但是总的来说到目前为止未见miR-106b和肿瘤细胞“干细胞特性”以及肿瘤放疗抵抗之间的相关性报道。miR-106b在肿瘤细胞“干细胞特性”以及肿瘤放疗抵抗所扮演的角色以及作用机制并不清楚。因此,本课题的研究目的：探讨miR-106b在结直肠癌肿瘤细胞干性以及放疗抵抗中所扮演何种角色,探讨这种角色背后的作用机制,为探讨结直肠癌发生、转移以及临床治疗提供重要理论依据。研究内容及方法：一.结直肠癌细胞株miR-106b的表达水平的检测采用RT-PCR的方法检测HT-29、SW480、LOVO、SW620等结直肠癌细胞株中miR-106b的表达水平。二. miR-106b对结直肠癌细胞放疗敏感性变化的观察1、体外实验：改变结直肠癌细胞miR-106b表达水平(过表达或干扰),经放疗处理后,通过MTT、平板克隆、流式、激光共聚焦以及凋亡相关蛋白表达的检测观察改变miR-106b表达水平后细胞对放疗敏感性的变化。2、动物试验：在体内环境下观察对放疗敏感性的变化。雌性BALB/c裸鼠,4-6周龄,18-22g, SPF条件下饲养。单细胞悬液,用无血清1640培养基调节细胞浓度至1×106/ml。在裸鼠右后肢皮下接种细胞悬液0.1m1,实验中每3天用游标卡尺测量肿瘤的最大径和与之垂直的横径,肿瘤体积=(长径×短径z)/2。两周后,当肿瘤体积达到约200mm3时,给予8Gy X线照射。每组6只,计算抑瘤率。3、采用免疫组化技术,分别检测裸鼠皮下成瘤组织内Bcl-2和Bax等凋亡相关分子的表达。三、miR-106b对结直肠癌细胞“干细胞特性”的影响1、改变结直肠癌细胞miR-106b表达水平(过表达或干扰),观察肿瘤细胞干细胞球形成效率。2、改变结直肠癌细胞miR-106b表达水平(过表达或干扰),通过荧光定量和western blot观察对肿瘤干细胞标志物表达水平的影响。3、改变结直肠癌细胞miR-106b表达水平(过表达或干扰)联合放疗处理后,通过肿瘤干细胞球形成实验观察其形成效率。4、改变结直肠癌细胞miR-106b表达水平(过表达或干扰)联合疗处理后,通过荧光定量和western blot观察对肿瘤干细胞标志物表达水平的影响。四、miR-106b作用靶基因的寻找1、通过生物信息学的方法预测和寻找miR-106b调控的肿瘤相关基因。2、利用荧光素酶报告系统检钡miR-106b与筛选出的靶基因的结合情况,确定与miR-106b直接作用的靶基因；3、利用qRT-PCR和Western blot方法,检测：miR-106b和靶基因在结直肠癌组织中的表达情况,并进行相关性分析。五、miR-106b靶基因功能验证1、构建过表达载体pcDNA3.1/PTEN和p21,用Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染SW620-Lenti-miR-106b细胞,恢复SW620-Lenti-miR-106b细胞中靶基因PTEN和p21表达水平,观察细胞对放疗敏感性的变化。2、购买siRNA/PTEN和siRNA/p21干扰序列,用Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染SW4800-ant i-mi R-106b细胞,干扰掉SW4800-anti-miR-106b细胞中靶基因PTEN和p21表达,观察细胞对放疗敏感性的变化。3、信号通路阻断剂阻断PTEN/PI3K/AKT信号通路,观察通路阻断后对放疗敏感性的变化。六、统计学分析：采用SPSS16.0统计软件进行数据分析。计量资料结果用x±s表示。荧光定量PCR各细胞样本的2-△△Ct值的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA);不同处理组间的比值、细胞数等采用两独立样本t检验；以P<0.05为差异具有统计学意义。结果：1miR-106b在结直肠癌细胞株中的表达情况对结直肠癌细胞株肿中hsa-miR-106b表达水平的检测发现,高分化的细胞株(HT-29和SW480)中miR-106b的表达要高于低分化细胞株(LOVO、SW620)。2. miR-106b增强结直肠癌细胞株对放疗的抵抗作用2.1通过MTT检测发现,过表达miR-106b的SW620细胞较之原细胞对放疗的敏感性明显降低,细胞的生存分数明显升高(*p<0.05)；相反在SW480细胞中干扰掉miR-106b的表达后对放疗的敏感性明显增强(**p<0.005)。2.2通过平板克隆形成实验发现,过表达niR-106b的SW620细胞较之原细胞对放疗的敏感性明显降低,克隆形成率升高(*p<0.05)；相反在SW480细胞中干扰掉miR-106b的表达后对放疗的敏感性明显增强(**p<0.05)。2.3通过激光共聚焦检测发现,过表达miR-106b的SW620细胞,经过放疗处理后,γ-H2AX小体的数量明显减少(*p<0.05),相反干扰掉miR-106b的SW480细胞经过放疗处理后小的数量明显增多(**p<0.05)。2.4通过western blot的检测发现过表达miR-106b的SW620细胞,经过放疗处理后,γ-H2AX蛋白表达明显减少,相反干扰掉miR-106b的SW480细胞经过放疗处理后γ-H2AX蛋白表达明显增多。2.5通过流式以及Western blot对细胞的凋亡变化进行检测,我们发现经过放疗处理后,细胞凋亡比例以及caspase-3蛋白表达明显减少,相反干扰掉miR-106b的SW480细胞经过放疗处理后细胞凋亡比例以及caspase-3蛋白表达明显升高。2.6通过体内荷瘤裸鼠辐射敏感性实验发现,过表达miR-106b的SW620细胞经过放疗处理后,所形成的皮下瘤体积明显大于空白对照组,经统计放疗处理后的肿瘤抑制率分别为53.3%和83.0%,统计学分析有显著差异(*p<0.001)。干扰掉miR-106b的SW480细胞,经过放疗处理后,所形成的皮下瘤体积明显小于空白对照组,放疗处理后的肿瘤抑制率分别为69.6%和87.2%,统计学分析有显著差异(**p<0.001)。2.7采用免疫组化技术,检测裸鼠皮下成瘤组织内Bcl-2和Bax等凋亡相关蛋白的表达,结果显示经过放疗处理后过表达miR-106b的SW620细胞,所形成的皮下瘤中Bcl-2表达明显升高,Bax明显降低。相反经过放疗处理后干扰掉miR-106b的SW480细胞,所形成的皮下瘤中Bcl-2表达降低,Bax表达明显升高。3. miR-106b参与维持肿瘤干细胞的“干细胞特性”3.1与空白对照组相比过表达miR-106b的SW620细胞,所形成的干细胞球数目明显增多,单个克隆球体积明显增大(*p<0.001)；相反干扰掉miR-106b的SW480细胞,所形成的干细胞球数量减少,体积较小(**p<0.005)。3.2通过荧光定量检测对肿瘤干细胞标志物表达水平的影响,我们发现发现与空白对照组相比过表达miR-106b的SW620细胞干细胞的相关标志物CD133、SOX2、OCT4和Bmil mRNA表达水平明显升高(*p<0.05)；相反干扰掉miR-106b的SW480细胞,干细胞的相关标志物表达水平明显降低(*p<0.05)。通过Western blot观察对肿瘤干细胞标志物表达水平的影响,发现与空白对照组相比过表达miR-106b的SW620细胞,干细胞的相关标志物CD133和SOX2蛋白表达水平明显升高但OCT4和Bmi1表达未见明显变化；相反相反经过放疗处理后干扰掉miR-106b的SW480细胞,经过放疗处理后,干细胞的相关标志物CD133和SOX2表达水平明显降低,但OCT4和Bmi1表达未见明显变化。3.3与空白对照组相比过表达miR-106b的SW620细胞,经过放疗处理后,所形成的干细胞球数目明显增多,单个克隆球体积明显增大(*p<0.001)；相反经过放疗处理后干扰掉miR-106b的SW480细胞,所形成的干细胞球数量减少,体积变小(*p<0.001)。3.4通过western blot观察对肿瘤干细胞标志物表达水平的影响,我们发现与空白对照组相比过表达miR-106b的SW620细胞,经过放疗处理后,干细胞的相关标志物CD133和SOX2表达水平明显升高；相反经过放疗处理后干扰掉miR-106b的SW480细胞,经过放疗处理后,干细胞的相关标志物CD133表达水平明显降低,但SOX2表达未见明显变化。4、PTEN和p21是miR-106b直接作用的靶基因4.1我们通过Targetscan (http://www.targetscan.org)进行生物信息学预测,发现PTEN、p21的3’UTR区含有miR-106b种子序列的结合位点。初步确定PTEN和p21是miR-106b直接作用的靶基因。4.2Western blot结果显示,在低表达miR-106b的SW620细胞中过表达后通过生物信息学预测的靶基因PTEN和p21蛋白表达显著下降,而在miR-106b表达水平较高的SW480细胞中干扰其表达后PTEN和p21蛋白表达明显升高。通过QRT-PCR技术检测我们发现改变miR-106b的表达水平后PTEN mRNA水平发生跟蛋白水平上一样的趋势,然而p21mRNA未见明显变化。4.3构建PTEN和p21的3’UTR表达载体PLuc-PTEN-3’-UTR PLuc-p21-3’-UTR以及Mut PTEN、p213’UTR的突变载体；荧光素酶报告系统结果显示,在转染PTEN、p21基因3’-UTR载体的实验组中,miR-106b组与NC组相比,荧光素酶活性均显著降低(*p<0.001和*p<0.005)；而miR-106b inhibitor组与NC inhibitor组相比,荧光素酶活性显著升高(*p<0.005,**p<0.001)。在转染Mut PTEN和p213’UTR突变载体的实验组中,miR-106b组与blank组相比荧光素酶活性无显著差异；miR-106b inhibitor与NC inhibitor组相比,荧光素酶活性均无显著差异。以上证明miR-106b能够作用于PTEN和p21基因3’UTR区,从而抑制了荧光素酶的活性。5恢复细胞中靶基因PTEN. p21的表达可逆转miR-106b导致的放疗敏感性的变化5.1成功构建并转染过表达载体pcDNA3.1-PTEN。成功构建过表达载体pcDNA3.1-PTEN。转染肿瘤细胞株SW620-miR-106b,经western Blot实验结果证明,与空白对照组相比,过表达后细胞PTEN表达明显增强。实验证实转染成功。5.2转染PTEN干扰片段到肿瘤细胞株SW480-anti-miR-106b,经western Blot实验结果证明,与空白对照组相比,转染PTEN干扰片段后细胞PTEN表达明显降低。实验证实转染成功。5.3通过MTT检测我们发现转染pcDNA3.1-PTEN后肿瘤细胞株SW620-miR-106b抑制效率要高于空白对照组(*p<0.005),而转染siRNA/PTEN后肿瘤细胞株SW480-anti-miR-106b抑制效率要低于空白对照组(*p<0.001)。5.4通过免疫荧光检测我们发现转染pcDNA3.1-PTEN联合放疗处理后肿瘤细胞株SW620-miR-106b γ-H2AX焦点数量明显增多(*p<0.005),而转染siRNA/PTEN联合放疗处理后肿瘤细胞株SW480-anti-miR-106b γ-H2AX焦点数量明显减少(*p<0.05)。5.5p21下调后增强SW620细胞的放疗敏感性。通过免疫荧光检测我们发现转染p21干扰片段联合放疗处理后肿瘤细胞株SW620γ-H2AX蛋白表达以及γ-H2AX焦点数量明显增多(*p<0.001)。5.6恢复p21表达后能够改变miR-106b的放疗抵抗成功构建过表达载体pcDNA3.1-p21=转染肿瘤细胞株SW620-miR-106b,经Western Blot实验结果证明,与空白对照组相比,过表达后细胞p21表达明显增强,实验证实转染成功。转染pcDNA3.1-p21后肿瘤细胞株SW620-miR-106b γ-H2AX蛋白表达以及γ-H2AX焦点数量明显增多(*p<0.05)。而转染siRNA/p21联合放疗处理后肿瘤细胞株SW480-anti-miR-106b γ-H2AX焦点数量未见明显变化。5.7miR-106b能够激活PI3K/AKT信号通路在SW620细胞中miR-106b过表达后蛋白表达升高,而在SW480细胞中干扰掉miR-106b表达后p-AKTl/2蛋白的表达也随之下降。5.8PI3K/AKT信号通路的阻断恢复miR-106b过表达导致的放疗抵抗通过阻断剂LY294002阻断SW620-miR-106b中的信号通路,观察对放疗敏感性的影响。经过阻断剂处理的细胞联合放疗处理后,免疫荧光检测发现γ-H2AX焦点数量显著升高(*p<0.05)。结论：1.miR-106b增强结直肠癌细胞的放疗抵抗2.miR-106b增强结直肠癌细胞的干细胞特性3.miR-106b靶向调控PTEN和p21的表达4.PI3K/AKT信号通路的阻断恢复miR-106b过表达导致的放疗抵抗本研究创新之处：1.首次阐明miR-106b在结直肠癌放疗抵抗中的作用。2. miR-106b通过靶向PTEN/PI3K/AKT和p21增强肿瘤的放疗抵抗。