micro RNA（mi RNA）是一类内源性长约21-24 nt的非编码RNA,通过剪切靶基因或抑制翻译对基因表达进行转录后调控,其中多种蛋白参与了mi RNA的形成,包括Dicer、HEN1等。HEN1最早是在拟南芥中被发现具有甲基转移酶活性,甲基化双链miRNA,使miRNA稳定存在,3’末端不被尿苷化而降解。HEN1是一类较保守的蛋白,其同源蛋白在植物、动物和部分细菌中均存在,但其生物学功能略有差别。在2007年,莱茵衣藻中首次发现大量mi RNA的存在,而mi RNA生物合成途径中甲基化修饰机制至今未有报道。为进一步探究CrHEN1是否具备甲基转移酶的活性,及其在mi RNA生物合成途径中的作用方式,本研究首先对比莱茵衣藻Crhen1突变株与野生株的小RNA组学测序结果,发现大部分mi RNA在Crhen1突变株中的表达水平均为下调,再经过q RT-PCR和Northern blot验证,发现miRNA的表达情况与测序结果相一致,证实了莱茵衣藻CrHEN1在mi RNA生物合成途径中起重要作用。具体研究结果如下:1.通过分析组学测序数据,筛选莱茵衣藻Crhen1突变株表达下调的mi RNA,并设计mi RNA探针。对莱茵衣藻Crhen1与野生株的mi RNA进行β-消除处理后,进行Northern blot凝胶电泳检测。结果表明CrHEN1有甲基转移酶活性,莱茵衣藻mi RNA生物合成过程中存在甲基化修饰过程。2.通过构建带GFP标签的pj1CF8-CrHEN1载体,利用珠磨法将重组载体转化到莱茵衣藻CC849中,得到衣藻转化子。激光共聚焦显微镜下观察衣藻转化子,发现荧光大部分定位于莱茵衣藻细胞核,少部分游离在细胞质中。说明莱茵衣藻mi RNA甲基化修饰发生在细胞核内。3.通过大肠杆菌原核表达系统获得CrHEN1结构域（Hd）和DCL3结构域（dicer）蛋白,将Hd和dicer纯化浓缩。利用ITC技术验证发现,Hd与dicer间发生相互作用。说明CrHEN1与DCL3在mi RNA生物合成过程中存在协同作用。4.通过莱茵衣藻CrHEN1在拟南芥hen1突变体中异源回复实验,CrHEN1能大幅度回复拟南芥hen1突变体的表型,进一步说明了莱茵衣藻CrHEN1的甲基化修饰生物学功能。综上,本研究证明了莱茵衣藻CrHEN1在mi RNA生物合成途径中于细胞核发生甲基化修饰,且CrHEN1与DCL3协同作用。本实验初步揭示了CrHEN1在mi RNA生物合成的调控机制,为进一步阐明低等单细胞生物的小RNA甲基化调控奠定基础,同时为研究莱茵衣藻miRNA生物合成机制提供重要的理论依据。