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背景:角膜是人眼睛表面一个透明的,无血管的组织,它的完整性对于正常视觉非常重要。它包括了分层的上皮细胞,它维持了角膜表面的完整和光滑,同时提供一个抵抗外界应激的屏障。许多因素如机械、热、化学损伤及微生物感染等可使透明的角膜出现灰白色的混浊,从而引起视力减退,甚至失明,称为角膜病。角膜病患病率高、致盲性强,是世界上仅次于白内障、排名第二位的致盲眼病;目前全世界约有2000万人口因角膜病致盲,而我国现有角膜致盲患者约300多万。同种异体角膜移植是目前角膜疾病患者最有效的方法,但由于供体的缺乏、免疫排斥或者生物相容性,感染等问题,修复治疗难以获得很好的疗效并满足日益增加的医疗需求。边缘区域的干细胞呈现了一个替代和再生角膜上皮的能力,参与了角膜表面动态平衡过程。角膜边缘干细胞具有自我再生和多方向分化能力,并且基于羊膜的移植方法成为一种再生上皮细胞的有效手段。然而该方法需要很长的培养时间,同时,我们并不清楚供者提供的羊膜移植是否会增加感染、炎症和其他生物研究安全性。为解决上述问题,异体角膜即人工角膜迫切需要。随着细胞治疗和组织工程的兴起,临床医学正步入一个“再生医学”的新阶段。生物材料,种子细胞和细胞因子是构建组织工程的三要素。在组织的修复过程中,种子细胞占据了很重要的成分。他们能在损伤部位聚集,增殖,同时分泌修复所需要的细胞外基质。目前,作为角膜组织工程的常用种子细胞包括角膜缘干细胞(LESCs),间充质干细胞(MSCs),胚胎干细胞(ESCs)和诱导的多能干细胞(iPSs)等。而这些细胞有自己的优势,同时也存在着一定的弊端,比如角膜缘干细胞获得途径不易,容易造成二次损伤。近年来,诱导多能干细胞衍生而来的间充质干细胞(iPSC-MSCs)表现出了干细胞一样的特性,能够分化为各类组织细胞,且在体外易获得,我们视之为一种可供选择的外源性种子细胞。然而,尚无文献报道外源性的iPSC-MSCs体内移植促进角膜修复的可行性和有效性。间质细胞衍生因子(SDF-1)在各类器官修复中起到募集CXCR4阳性细胞的作用。既往研究表明SDF-1alpha复合温敏壳聚糖/明胶支架能够促进干细胞募集和减少炎症细胞的浸润。也有研究证实了角膜纤维细胞能够表达SDF-1及其受体CXCR4;且SDF-1/CXCR4轴对与维持角膜缘干细胞LESCs的特性至关重要。这些研究暗示了 SDF-1或许在募集干细胞促进角膜修复方面具有潜在的能力,然而其在角膜损伤修复中的具体作用并未被研究过。通过支架材料复合干细胞或是生长因子/细胞因子等手段,能够促使身体已损伤组织的再生,为提高角膜等组织的修复质量带来了全新的机会。在此研究中,我们通过复合SDF-1和温敏壳聚糖/明胶支架,研究该复合物支架能否进一步促进损伤角膜的修复。我们的研究将为损伤角膜的修复带来一种新的方式。我们的研究分为三部分:(1)温敏壳聚糖/明胶水凝胶的制备和特性分析;(2)间质细胞衍生因子(SDF-1)复合温敏壳聚糖/明胶支架构建组织工程支架用于损伤角膜上皮的修复,评估SDF-1趋化的内源性细胞对角膜损伤修复的促进作用;(3)外源性种子细胞(iPSC-MSCs)复合温敏壳聚糖/明胶支架构建组织工程角膜,评估对角膜基质层损伤修复的促进作用:第一章温敏壳聚糖/明胶水凝胶的制备和特性分析目的:壳聚糖来源于自然界的甲壳素,具有许多优良的生物特性。本部分的目的是研究温度敏感的壳聚糖/明胶支架的制备及其特性分析。方法与结果:体外试验中,我们制备了温度敏感的壳聚糖/明胶支架的制备及其特性分析。结果显示温敏壳聚糖/明胶支架具有温度敏感性、优良的透光性、组织相容性且其表面具有孔径,能够缓释SDF-1alpha的能力等。结论:温度敏感性的壳聚糖/明胶支架具有优良的特性且能够缓释细胞因子,可能是角膜上皮及基质损伤修复的理想材料。第二章间质细胞衍生因子(SDF-1)复合温敏壳聚糖/明胶支架构建组织工程支架用于损伤角膜上皮的修复目的:本研究目的是通过复合外源性的间质细胞衍生因子来构建一种具有生物活性的、能选择性促进内源性细胞迁移的温敏壳聚糖/明胶支架用于损伤角膜上皮的修复。方法与结果:在体外,我们评估了外源性间质细胞衍生因子(SDF-1)对大鼠角膜缘干细胞(LESCs)和角膜间充质干细胞(MSCs)的增殖、转移和相关基因表达的影响,构建的支架促进角膜上皮再生的效率在大鼠体内角膜严重碱烧伤模型中测定。体外结果显示LESCs和MSCs的角膜修复相关基因表达和细胞迁移对外源性SDF-1敏感。在大鼠碱烧伤损伤模型中,术后7天外源性SDF-1在损伤部位可以募集更多的角膜缘干细胞迁移修复,表达更多的生长因子同时减少炎症细胞的浸润,从而加速角膜上皮的修复。13天后,SDF-1处理的实验组较单纯材料的对照组表现为更透明的角膜和更少的角膜新生血管,同时再生的上皮排列更接近于正常角膜。结论:这项研究阐明了外源性SDF-1和温敏壳聚糖/明胶支架协同作用可以通过增加内源性角膜缘干细胞的集聚、加强局部内源性SDF-1和表皮生长因子、肝细胞生长因子等、减少炎症细胞的积累来提高角膜上皮再生的效率。因此外源性SDF-1复合温敏壳聚糖/明胶支架为角膜上皮组织工程提供了一种实用性方法。第三章外源性种子细胞(iPSC-MSCs)复合温敏壳聚糖/明胶支架构建组织工程角膜,评估对角膜基质层损伤修复的促进作用目的:研究iPSC-MSCs复合温敏壳聚糖/明胶支架能否促进角膜基质层的修复。方法与结果:体外试验中,我们评估了鉴定了 iPSC-MSCs的干细胞特性,并且成功提取了iPSC-MSCs分泌的外泌体,鉴定了外泌体。研究了外泌体对角膜上皮细胞及角膜间充质干细胞增殖、迁移等特性。在体内试验中,我们选择大鼠浅板层损伤模型作为动物模型,将iPSC-MSCs及其外泌体种植于温敏壳聚糖/明胶支架上后移植入大鼠体内评估其修复效果。结果显示iPSC-MSCs显示了干细胞的一般特性。在体外成功提取出了外泌体并鉴定了其特性。体外种植的细胞在温敏壳聚糖/明胶支架上增殖良好,无细胞毒性。体内在术后3天和7天的时间点,其促进了更多成纤维样细胞的长入,减少了炎症细胞的浸润。加了 iPSC-MSCs组和加了其来源的外泌体组表现接近,修复的角膜更加透明,胶原结构更加接近于正常角膜。结论:移植的iPSC-MSCs通过释放外泌体和相关生长因子等来促进损伤角膜组织的修复。因此,iPSC-MSCs复合的温敏壳聚糖/明胶支架是具有一定的临床应用价值的角膜组织工程支架。