论文部分内容阅读
目的:对干细胞类器官利基因子领域的相关文献信息进行文献计量学及可视化分析,筛选出研究较为成熟的经典干细胞利基因子,构建舌癌干细胞类器官的培养体系;通过生物信息学方法鉴定舌癌干性相关的关键基因,并利用关键基因和利基因子的蛋白互作网络初步验证经典干细胞利基因子在舌癌的适用性;最终通过细胞学实验,检测干性标志物的表达情况以初步验证干细胞利基因子组成的类器官培养体系对于舌癌干细胞的富集作用。方法:实验分三部分。（1）应用文献计量学方法对干细胞类器官利基因子领域的研究论文进行分析。从时间、机构、作者、关键词和被引文献等几个方面收集数据,用Citespace、VOSviewer、R包Bibliometrix等软件进行可视化,通过节点文献以及节点关键词寻找干细胞类器官利基因子领域中研究较为成熟的经典干细胞利基因子,并构建舌癌干细胞类器官的培养体系。（2）舌癌RNA-seq数据和相关临床信息从癌症基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）下载。加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-Expression network analysis,WGCNA）用于模块化差异基因。基于干细胞指数m RNAsi,确定重要舌癌干性相关的模块和关键基因。对关键基因GO以及KEGG功能富集,并利用关键基因和利基因子的蛋白互作网络初步验证干细胞利基因子在舌癌的适配性。（3）以舌癌细胞CAL-27为对象,通过采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR）等实验检测舌癌细胞干性标志物的表达,逐步验证干细胞利基因子组成的类器官培养体系对于舌癌干细胞的富集作用。结果:（1）Web of Science核心合集数据库共收录干细胞类器官利基领域1053篇研究论文,生产力最高的机构是Harvard med sch,发文量最高作者是Clevers,全球的作者和机构的合作都非常紧密;从节点文献中提取出经典的干细胞类器官培养体系,包括EGF、Rspondin1和Noggin利基因子,并作为舌癌干细胞类器官培养体系的基本框架（本研究称为ERN条件）。关键词分析发现β-连环蛋白途径以及FGF是这一领域研究较为成熟的干细胞类器官利基因子,可作为候选的利基因子以加强ERN条件的富集效应。（2）在TCGA数据库中的差异表达分析显示,正常组织和舌癌组织的m RNAsi具有显著差异,舌癌组织明显要高于正常组织,P＜0.05。在生存分析中,观察到m RNAsi评分高的患者比m RNAsi评分低的患者总体生存更差,P＜0.05。基于m RNAsi确定了22个关键基因,GO以及KEGG功能富集发现关键基因都集中在细胞周期、范可尼贫血通路,P＜0.05,FDR＜0.25。基因显著性排名前5的关键基因和利基因子的蛋白互作网络发现:除了AUNIP外,各种利基因子以及关键基因均以CDK1为中心建立了紧密的联系。这验证了利基因子EGF、Rspondin1、Noggin、FGF和β-连环蛋白与舌癌干性的相关性,并初步验证它们作于用舌癌干细胞的适配性。（3）倒置显微镜下观察发现舌癌细胞在类器官培养模式下增殖成球,排列紧密,但ERN条件下的细胞球体比10%血清条件下的更大、更密集,更少见细胞残骸。而在常规10%血清2D培养条件下的细胞呈多边形松散地平铺在瓶底。实时荧光定量PCR结果显示:3D ERN组与3D 10%血清组相比,舌癌细胞干性标志物CD44 m RNA的表达量明显上调,差异具有统计学意义,P＜0.05。而3D 10%血清组与2D 10%血清组相比,干性标志物CD44 m RNA的表达量仅呈上升趋势,差异无统计学意义,P＞0.05。此外,相对于3D 10%血清组,3D ERN+C+F组明显上调了舌癌干性标志物CD44的表达,差异具有统计学意义,P＜0.05。而且3D ERN+C+F组CD44的相对表达量均比3D ERN组、3D ERN+F组显著增高,差异具有统计学意义,P＜0.05。然而,3D ERN组、3D ERN+C组和3D ERN+F组分别与3D 10%血清组相比,CD44的表达差异虽无统计学意义,P＞0.05,但其总体呈上升趋势。Western Blot实验结果提示:3D ERN+C+F组的舌癌细胞CD44的蛋白表达水平较3D ERN组或3D 10%血清组高,呈上升趋势。结论:（1）对干细胞类器官利基因子领域的出版物从文献计量学的角度进行了层次化梳理以及可视化分析。同时发现β-连环蛋白途径以及FGF是这一领域研究较为成熟的利基因子。而EGF、Rspondin1和Noggin利基因子组合则是经典的干细胞类器官培养体系。（2）舌癌患者的m RNAsi高评分可能预示着预后不良,并以此鉴定了22个舌癌干性相关的关键基因。（3）本研究筛选出舌癌干细胞类器官利基因子并构建了培养体系,包括EGF、Rspondin1、Noggin、FGF、CHIR99021。在这一体系下,舌癌干细胞相关标志物的表达明显上调。