背景与目的在中国,近年来肺癌的发病率和死亡率均高居首位。全球及美国癌症最新统计数据显示,癌症新发病例数明显增加,其中肺癌新发病例数及死亡率攀升,在男性中均为首位。肺癌根据病理类型分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%,而肺腺癌是非小细胞肺癌最常见的组织学类型之一。肺腺癌的主要治疗手段包括手术、化疗、放疗、分子靶向治疗等。近十年来,随着大型精确放疗设备的不断研制开发,计算机技术和医学影像学技术的进步,放射治疗的技术水平不断提高,副反应和并发症明显减少,放射治疗已经成为治疗肿瘤的主要而有效的手段之一。肺腺癌的起病隐匿,多数患者就诊时已为局部晚期或出现远处转移,往往失去根治性手术机会。术后辅助放疗及放化疗同步已成为临床中常用的综合治疗策略。临床中,放疗后局部复发或未控的患者十分常见,因此,放疗抵抗成为降低放射治疗临床疗效、影响患者预后的主要障碍之一。肿瘤放疗抵抗的机制比较多见的有:肿瘤干细胞、DNA损伤修复、肿瘤乏氧状态、P53突变、自噬增强、Micro RNAs调节异常、各种生长因子过表达等。自噬是衰老的细胞器或者大分子物质在溶酶体中降解为氨基酸、脂肪酸以及核苷酸进行重复利用的程序性死亡过程,它在维持细胞自身动态平衡和基因组完整性中起重要作用。我们实验室前期用逐渐增加多西他赛浓度的方法在体外诱导人肺腺癌SPC-A1细胞,自建了SPC-A1耐多西他赛细胞株SPC-A1/DTX。并且,实验室前期研究已经证实,高水平的自噬可促进人肺腺癌细胞对多西他赛耐药的产生。而自噬怎样参与到肺腺癌细胞放疗抵抗形成的过程及机制,国内外研究尚不充分。本研究旨在通过研究自噬对耐药细胞放疗抵抗产生的原因及其可能的机制,并探讨了调节自噬水平对人肺腺癌细胞放疗敏感性的影响。材料与方法1、采用透射电镜观察人肺腺癌亲本细胞SPC-A1和耐药细胞SPC-A1/DTX自噬溶酶体形成情况,两株细胞各分为两组:未经放射线照射组及6Gy剂量照射组。处理后的细胞分别在透射电镜下观察自噬体形成情况。2、荧光显微镜检测亲本人肺腺癌细胞SPC-A1和耐药细胞SPC-A1/DTX放疗前后的GFP-LC3荧光密度变化,以及给予药物(3-MA)及下调Survivin表达抑制自噬后,耐药株株细胞GFP-LC3荧光密度变化。亲本细胞与耐药细胞比较时,两株细胞各分为两组:未经放射线照射组及6Gy剂量照射组;抑制自噬水平时,耐药细胞分为4组:空白对照组,3-MA/si RNA-Survivin组,6Gy/6Gy+si RNA-control照射组,3-MA/si RNA-Survivin+6Gy照射组。3、Western Blot技术测定自噬相关蛋白标志物LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、beclin-1、Survivin蛋白表达变化。亲本细胞与耐药细胞比较时,两株细胞各分为两组:未经放射线照射组及6Gy剂量照射组。在SPC-A1/DTX细胞中,应用自噬抑制剂3-MA预处理或使用Survivin si RNA下调Survivin表达,样品蛋白分为4组处理组:空白对照组,3-MA/si RNA-Survivin组,6Gy/6Gy+si RNA-control照射组,3-MA/si RNA-Survivin+6Gy照射组。4、流式细胞学分析凋亡和细胞周期分布变化。5、MTT和克隆形成实验分别检测细胞生存能力和增殖能力改变情况。结果1、化疗耐药的人肺腺癌耐多西他赛细胞SPC-A1/DTX比亲本细胞SPC-A1更耐受放疗,接受相同放疗剂量后增殖能力更强,ED50值较高(耐药株均值约为7.5Gy,亲本株均值约为4Gy)(P<0.05)。2、SPC-A1/DTX比SPC-A1自噬小体明显增多、带GFP标签的LC3荧光密度增强,自噬相关蛋白标志物LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、beclin-1表达增强(P<0.05),提示自噬水平较高。3、放射线同时可引起两种细胞株自噬水平的增高。给予药物(自噬抑制剂3-MA)预先处理耐药细胞,或者使用Survivin si RNA下调Survivin表达后给予放疗,可显著抑制自噬标志物LC3和beclin-1、上调p62表达(P<0.05),使GFP-LC3荧光密度明显降低,提示可显著降低耐药细胞的自噬水平。4、给予药物(自噬抑制剂3-MA)预先处理耐药细胞,或者使用Survivin si RNA下调Survivin表达,可降低SPC-A1/DTX细胞生存能力和增殖能力、增加放射敏感的G2/M期细胞比例、增加凋亡率(P<0.05),即增强了SPC-A1/DTX的放疗敏感性。结论自噬为SPC-A1/DTX细胞耐受放射治疗提供了一个自我保护的机制。自噬促进人肺腺癌耐多西他赛细胞放疗抵抗产生,而抑制自噬成为逆转人肺腺癌细胞放、化疗耐受的一个可能的策略。