黄曲霉毒素是一类毒性很大的强致癌、致畸性物质,尤其以AFB1的毒性最大。黄曲霉毒素对粮食和食品的污染较为严重,随着人们对食品安全意识的提高,对黄曲霉毒素的去毒显得尤为重要。因生物酶降解黄曲霉毒素时可产生无毒的产物、不影响产品质量而备受人们关注,对可降解黄曲霉毒素的酶的研究也成为当下的热点。本实验室在前期的研究中通过密码子优化和重组表达已获得具有较高活性的黄曲霉毒素解毒酶,但在研究时发现其对温度较为敏感。为了能够在酶分子水平上对酶进行定向改造来到达提高酶热稳定性和活性目的,本文对其热稳定性和降解机理进行了研究。主要的工作如下:(1)研究重要的氨基酸位点前期通过同源模建和分子对接,发现酶分子中水解结构域中包含有锌指结构的空腔与底物分子有较高的匹配度,从而确定了包含锌指结构在内的10个重要氨基酸位点,进行了单点突变获得10个突变体,表达纯化后测定活性,结果表明这些氨基酸位点的突变使酶的活性降低至野生型酶活性61.7%-91.4%(即突变体酶活性降低了 8.6%-38.3%),说明锌指结构可能不是重要的活性位点,黄曲霉毒素解毒酶对底物的降解不一定是水解机理。基于氧化还原机理,结合分子对接和计算机化学的理论计算,再次修正后,确定13个可能重要氨基酸位点,经突变、表达、纯化及测活,大部分突变体酶的活性降低不大,其比活力是野生型比活力的55.79%-104.73%;但其中R542A活性有比较明显的降低,其活性是野生型的41.73%,说明R542可能是黄曲霉毒素降解酶催化过程中比较重要的氨基酸残基。(2)研究酶热稳定性分别测定野生型的纯酶和粗酶在0℃和30℃下比活力随时间的变化曲线,发现纯酶0℃和30℃的半衰期分别为5.2h、0.9h,说明纯酶活性受温度的影响较大,并且粗酶与纯酶相比具有较高的活性和热稳定性。将可能与锌离子有结合的四个氨基酸位点进行两两双位点突变获得三个双位点突变体,表达纯化后,测定其在0℃的半衰期(0.8h、1.1h、1.2h),与野生型蛋白0℃的半衰期(5.2h)比较,发现双位点突变体蛋白的半衰期缩短较多,说明锌离子结构有助于酶空间结构的稳定。(3)降解产物的分离及其特性研究通过TLC实验分离浓缩得到降解产物,对其进行紫外和荧光光谱扫描,并利用高分辨质谱分析,发现产物显黄色,在365nm紫外吸收较弱,222nm处有吸收峰,265nm处也存在紫外吸收但峰形不规则,且降解得到的产物仍保留荧光特性,但荧光性减弱,推测酶对底物的作用位置为双呋喃环上的双键。