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研究背景：增生性瘢痕是创面愈合后期组织过度修复的结果，在其形成过程中，涉及到多种细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）以及信号通路的参与，主要表现为成纤维细胞过度增殖及胶原纤维异常增生，而这些过程都必须依赖于瘢痕微血管系统提供充足的营养成分。随着近年来人们逐渐认识到血管生成在增生性瘢痕中的重要作用，探索血管生成的机制成为急需解决的问题。瘢痕微血管生成的过程需要内皮细胞与ECM的相互作用，整合素在这个过程中负责沟通二者之间的联系。整合素连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）作为整合素通路的关键激酶，介导细胞与ECM之间的信号传递，具有调节细胞的增殖、凋亡、迁移及血管形成等生物学功能。在对肿瘤的血管生成、糖尿病视网膜病变及胚胎发育等的研究中发现，ILK具有促进血管生成的作用，它通过重组内皮细胞骨架蛋白、促进细胞迁移、维持细胞存活及增殖等方面调节血管生成，但其在瘢痕形成中的作用和机制，目前尚未见有相关研究。本研究在此基础上，以增生期瘢痕组织中分离提纯出的瘢痕微血管内皮细胞（Human scar microvascular endothelial cells, HSMECs）为研究对象，利用小分子siRNA干扰技术转染细胞，沉默ILK的表达；同时使用PI3K特异性抑制剂LY294002阻断PI3K-AKT通路，观察HSMECs的迁移能力及体外血管形成能力的改变，从细胞形态学上初步探讨ILK对瘢痕微血管生成的作用。第一部分HSMECs的分离、培养、纯化、鉴定及转染目的探索从增生性瘢痕中分离提纯HSMECs的方法，并检测小分子siRNA干扰及LY294002特异性阻断信号通路对ILK mRNA和蛋白表达的影响。方法收集12例增生期瘢痕，采用机械法，结合Ⅰ型胶原酶消化法分离出原代HSMECs，并利用免疫磁珠法提纯，采用免疫荧光法和流式细胞技术鉴定和检测细胞纯度；选取提纯后第2～4代生长状态良好的细胞作为研究对象，分成四组：⑴空白对照组，⑵阴性对照组：只加入转染试剂，⑶LY29400250nM组，⑷ILK siRNA组，RT-PCR法及Western Blot法检测ILK mRNA和蛋白表达的变化。结果Factor Ⅷ免疫荧光及CD31流式细胞结果显示，分离提纯的HSMECs纯度可达90%以上；RT-PCR及Western Blot结果显示，ILK siRNA组HSMECs内ILK mRNA表达水平（t=13.151，P=0.006）及蛋白表达水平（t=36.656，P=0.000）均明显受到抑制，而LY294002组ILK的表达虽略有降低，但无统计学差异。结论利用Ⅰ型胶原酶消化法及免疫磁珠的应用，可从增生性瘢痕组织中分离提纯出较高纯度HSMECs，通过ILK siRNA干扰技术可有效降低ILK mRNA及蛋白的表达。第二部分ILK对人瘢痕微血管内皮细胞迁移能力的影响目的探讨ILK及LY294002对HSMECs迁移能力的影响方法利用Transwell法，将消化后的HSMECs用不含血清的DMEM重悬，种入上层小室，分别在2h、4h、6h、8h、10h和12h这6个时间点终止细胞迁移实验，刮去迁移膜上层未迁移的细胞，将迁移膜固定、染色后进行封片、采图，计数迁移细胞数，制作时间曲线；根据时间曲线选取最佳观察时间点进行分组实验，同第一部分将实验分成四组，进行细胞迁移实验，观察不同处理因素对HSMECs迁移能力的影响。结果HSMECs迁移时间曲线显示在10h时迁移过网的细胞数较多，且分布较均匀，选择其为最佳观察时间点；分组处理后的细胞迁移数量显示ILK siRNA组（t=71.938，P=0.000）与LY294002组（t=84.111，P=0.000）细胞迁移数均显著降低。结论HSMECs的迁移能力与ILK的表达呈正相关，当ILK表达下调的同时，HSMECs的迁移能力明显降低。第三部分ILK在体外血管形成中对HSMECs的调控作用目的探讨在体外模拟血管形成的过程中，ILK及LY294002对HSMECs的调控作用。方法将冻融的ECMatrix基质胶在冰面上均匀的铺入预冷的48孔板中，37℃温箱孵育使其凝胶，然后将HSMECs种入胶面上，置入温箱孵育，分别在2h、4h、6h、8h、10h和12h这6个时间点终止实验，将细胞固定、染色，依据血管形成模式评分表随机选择8个视野进行评分，制作时间曲线图；通过时间曲线选择最佳观察时间点，同第一部分将实验分成四组，进行血管形成实验，观察LY294002及ILK对体外血管形成能力的影响。结果体外血管形成时间曲线结果显示在8h时可观察到复杂的网状血管结出现，且HSMECs相对较分散，选择8h为最佳观察时间点；分组实验结果显示，ILK表达沉默后，体外血管形成能力明显降低，8h时无法形成完整的网络结构（t=12.965，P=0.006），LY294002显示出同样的作用（t=6.653，P=0.003）。结论在ILK表达下调的情况下，HSMECs体外血管形成能力显著降低，由此推论ILK可能参与对瘢痕微血管生成的调控。