论文部分内容阅读
背景与目的:N-myc扩增与神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)恶性表型和快速进展密切相关,然而促发N-myc扩增的机制尚未阐明。文献报道,微小RNA-221(microRNA-221,mi R-221)在N-myc扩增的NB中表达上调。本课题以miR-221为切入点,结合临床病例,分析miR-221在NB中的表达,及与N-myc表达和患者临床病例特征的相关性,通过NB细胞的体内外实验,探讨miR-221对NB细胞增殖的影响及对N-myc表达的调控机制。方法:1.miR-221在NB中的表达及其与N-myc表达和临床病例特征相关性分析:收集31例NB患儿病例资料及石蜡切片,锁核酸原位杂交(Locked nucleic acid-in situ hybridization,LNA-ISH)和实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测NB组织中miR-221表达,免疫组化检测NB组织中N-myc表达,分析miR-221与N-myc表达和NB临床病例特征的相关性;qRT-PCR和Western blot检测四种NB细胞系(SH-SY5Y、SK-N-SH、SK-N-DZ和IMR-32)中miR-221、n-myc表达。2.mir-221对nb增殖的影响:构建mir-221过表达慢病毒载体并建立稳定转染过表达和对照载体的细胞株(分别命名为mir-221-up和control细胞),qrt-pcr检测mir-221的表达水平,cck8法和克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期变化;将sh-sy5y,control及mir-221-up细胞分别接种至裸鼠背部皮下,建立裸鼠移植瘤模型,动态观察移植瘤的生长,测量瘤体重量和体积,ki67染色检测移植瘤细胞增殖能力。3.mir-221促进n-myc扩增的分子机制:qrt-pcr和westernblot检测sh-sy5y,control及mir-221-up细胞和移植瘤中nlk,lef1,p-lef1,n-mycmrna和蛋白的表达,免疫荧光检测细胞中nlk,p-lef1,n-myc蛋白的表达,免疫组化检测移植瘤中nlk,p-lef1,n-myc蛋白的表达。结果:1.qrt-pcr和lna-ish结合免疫组化结果显示mir-221在n-myc高表达的nb组织中表达显著增多(p<0.05);临床病例统计分析发现mir-221表达与nb患儿生存时间成负相关,mir-221高表达者生存时间短(p=0.0425);但mir-221表达水平与nb患儿年龄、性别、肿瘤大小、分化、转移与肿瘤分期无关(p>0.05);qrt-pcr和westernblot结果发现,与sh-sy5y细胞相比,sk-n-dz和imr-32细胞中mir-221表达,n-myc的mrna和蛋白表达均显著增高(p<0.05),而sk-n-sh细胞无显著变化(p>0.05)。2.成功构建mir-221过表达慢病毒载体;与sh-sy5y细胞相比,mir-221-up细胞中mir-221表达升高约7倍(p<0.05);cck8和克隆形成实验结果显示mir-221-up细胞的增殖能力较sh-sy5y细胞明显增强(p<0.05);流式细胞术分析发现mir-221-up细胞较sh-sy5y细胞g0/g1期细胞比例明显减少(p<0.05),s期细胞比例显著增多(p<0.05);与sh-sy5y细胞注射组相比,mir-221-up细胞注射组裸鼠移植瘤的体积和重量显著增加(p<0.05);ki67结果表明mir-221-up细胞注射组ki67阳性细胞较sh-sy5y细胞注射组明显增多(p<0.05)。3.与sh-sy5y细胞相比,qrt-pcr结果发现mir-221-up细胞中n-myc的mrna明显增加(p<0.05),而nlk和lef1无显著变化(p>0.05),westernblot和免疫荧光结果显示,mir-221-up细胞中nlk和p-lef1蛋白表达均明显减少(p<0.05),n-myc蛋白表达明显增加(p<0.05),而lef1蛋白表达无明显变化(p>0.05);与sh-sy5y细胞注射组相比,qrt-pcr结果发现mir-221-up细胞注射组中n-myc的mrna明显增加(p<0.05),而nlk和lef1无显著变化(p>0.05),westernblot和免疫组化发现mir-221-up细胞注射组移植瘤中nlk和p-lef1蛋白表达均明显降低(p<0.05),n-myc蛋白表达明显增多(p<0.05),而lef1蛋白表达无明显变化(p>0.05)。结论:1.mir-221在n-myc高表达的nb组织和细胞中表达显著增加,高表达mir-221的nb患儿生存时间短,表明mir-221高表达提示nb患儿预后不良。2.miR-221通过减低G1/S期阻滞而促进NB细胞增殖。3.miR-22通过调控NLK表达,抑制LEF1磷酸化,促进NB中N-myc蛋白表达。