目的：建立一种检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2和乙型流感病毒的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法与多重PCR法,并将建立的方法进行初步临床应用。方法：1.设计针对甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒HA基因的引物,分别进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR反应,用人的GAPDH基因作为内参判断标本来源和实施质量控制的依据,同时进行熔解曲线和Tm值分析。优化荧光定量PCR的反应体系与反应条件,检测该方法的敏感性,特异性和重复性并进行盲样检测评价实验。2.利用以上四对引物,建立可同时扩增出四个流感病毒特异性片段的多重PCR的方法,并进行敏感性、特异性和盲样检测评价实验。结果：1.SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR构建的荧光定量标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为：95.588%,检测灵敏度为101copies/反应,从病毒核酸提取到检测完成需3.5小时,重现性好。该方法与H5、H7、H9亚型流感病毒及副流感病毒1、2、3型均无交叉反应,成功地验证性检验了32份盲样标本。2.多重PCR可同时扩增出流感病毒亚型的HA基因片段长度分别为106bp(甲型H1N1),135bp(季节性H1N1),118bp(季节性H3N2),170bp(乙型流感病毒)。该实验检测甲型H1N1(A/colifornia/07/2009)的灵敏度为102copies/反应。特异性实验结果显示每对引物只检测对应的病毒,32份盲样检测结果特异性好。结论：1.本研究建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法敏感、不需荧光标记探针、成本低及高通量,能用于人类流感病毒的分型检测。2.建立的多重PCR方法可同时检测甲型H1N1及季节性流感病毒,且敏感性和特异性强,可用于基层流感监测部门对人类流感病毒的鉴别分型检测。