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灵芝历史悠久,远在春秋时期既被视为祥瑞的征兆,有“瑞芝”之称。到了汉朝时期,便有书籍记载灵芝的药学用途,其中叙述最详细的当属《神农本草经》,书中记载灵芝可“久食轻身不老,延年神仙”。近年来,学者们对灵芝进行系统、科学地研究,灵芝多糖作为灵芝生物活性的主要物质基础,俨然已成为研究热点。关于灵芝多糖的研究主要包括多糖的分离纯化、结构分析、生物活性、药效机理以及灵芝多糖产品的质量监测等方面。本课题构建了灵芝菌丝体多糖的HPLC指纹图谱,考察了灵芝菌丝体多糖及其多糖级分的HPLC指纹图谱和免疫活性的谱效关系,初步探究了灵芝液体深层发酵对其指纹图谱正相关峰的影响,为灵芝菌丝体多糖的质量监测和灵芝菌种的发酵优化提供依据。以浙江、山东、安徽、江西和江苏等地区11个厂家的液体深层发酵灵芝菌丝体粉为原料,选择较为温和的水浴法提取多糖。脱色、脱蛋白后,11种灵芝菌丝体多糖的纯度介于77%~86%。单糖组成分析显示11种多糖样品的单糖组成种类和摩尔比各异,但均含有Man、Rha、Glc、Gal、Xyl、Ara、Fuc和少量糖醛酸。IR和13C NMR结果表明,4号样品(包括菌丝体多糖和发酵液多糖)的异头碳构型为β型。灵芝菌丝体多糖的分子量分布范围较广,从几千到百万不等。建立了灵芝菌丝体多糖的部分酸水解耦合PMP柱前衍生化RP-HPLC标准指纹图谱,得到17个共有特征峰,其中有8个单糖峰,共有峰的面积和占总面积的98.7%以上。10种菌丝体提取的多糖样品的指纹图谱与其标准指纹图谱的相似度均>0.953,4号样品的相似度为0.874。比较了灵芝菌丝体多糖、子实体多糖和孢子粉多糖的RP-HPLC标准指纹图谱,菌丝体多糖和孢子粉多糖的相似度为0.590,而菌丝体多糖和子实体多糖的相似度为0.968,可见通过该方法可以区分灵芝菌丝体多糖和孢子粉多糖,无法区分灵芝菌丝体多糖和子实体多糖。灵芝菌丝体多糖分子量分布中,区间50 k Da~100 k Da、100 k Da~500 k Da、500k Da~1×103 k Da和>1×103 k Da与多糖促进小鼠脾细胞增殖率呈正相关,多糖的免疫活性主要取决于500 k Da~1×103 k Da和>1×103 k Da两个大分子量区间。RP-HPLC指纹图谱中,寡糖峰峰2、峰3、峰5、峰6和峰9以及单糖峰Xyl、Rha、Gal、Ara、Fuc均为促进小鼠脾细胞增殖的正相关峰。4号多糖样品分离纯化后,得到2个中性多糖GLMNP1和GLMNP2以及3个酸性多糖GLMAP1、GLMAP2和GLMAP3。HPSEC检测其分子量分别为6.61×103 k Da、14.1 k Da、5.01×103 k Da、94.3 k Da和9.79 k Da,纯度分别为94.13%、91.79%、93.15%、91.50%和92.55%。单糖分析显示,5个多糖级分主要含Man、Glc N、Rha、Glc、Gal、Ara、Xyl和Fuc,但它们的单糖摩尔比各异。多糖级分的分子量分布与其免疫活性的相关性分析表明,大分子量区间50 k Da~100 k Da和100 k Da~500 k Da与多糖免疫活性呈正相关。多糖级分的RP-HPLC指纹图谱中有16个特征峰,寡糖峰峰2、峰6和峰7以及单糖峰Glc N、Ara、Xyl、Rha和Fuc为正相关峰。多糖和多糖级分的共有单糖特征峰Xyl、Rha、Ara和Fuc为正相关指纹峰。发酵时间影响灵芝菌丝体多糖的分子量分布,发酵第6~8天是合成大分子量多糖的高峰期,发酵后期最大分子量区间多糖增多。以葡萄糖、麦芽糖或可溶性淀粉为碳源有利于大分子量多糖的合成,酵母膏和黄豆饼粉作为氮源时大分子量区间多糖含量更高。无机氮源培养的灵芝多糖中单糖种类较少,有机氮源发酵时单糖种类多且活性正相关单糖峰含量更多。麦芽糖作为碳源有利于合成单糖正相关峰Xyl、Rha、Gal、Ara和Fuc。综上所述,灵芝菌丝体多糖的HPLC指纹图谱可用于其掺假鉴定,灵芝菌丝体多糖的指纹图谱和其免疫活性的正相关性结果可以指导灵芝菌种的液体深层发酵从而获得优质的多糖产物。