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肿瘤的发生与维持离不开新生血管的形成,肿瘤细胞的侵袭更依赖于肿瘤内新生血管向远处转移。寻找一个合适新生血管的靶标,是治疗肿瘤的关键。目前认为分化抑制因子1(Id1)是一种准原癌基因的侯选分子和促血管生成因子,多项研究提示其表达在肿瘤的血管生成过程中可能起着重要作用。Id是螺旋-环-螺旋(HLH)转录因子亚家族的一个成员,通过影响其下游分子的转录而发挥作用,但其参与血管生成的具体机制尚不明确。基质金属蛋白酶(MMPs)是细胞外基质(ECM)和基底膜重塑所必需的条件,目前认为MMPs并不仅仅只降解ECM成分,其更多的是作用于血管的发生。MMPs几乎在所有的人类肿瘤中广泛而大量表达,大量研究证实MMPs的高水平表达与肿瘤的侵袭和/或转移能力以及不良预后有关,并在肿瘤的血管生成中起着决定性作用。有报道提出,在Id1基因敲除的鼠胚胎纤维母细胞的培养上清中MMP-2的活性下降。本研究着重探讨了Id1通过调控MMPs发挥促胃癌血管生成的作用。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在多种肿瘤的发生、发展中发挥重要的作用,激发血管生成是其促癌机制之一,但其调节机制尚不明确。我实验室的前期工作提示,COX-2抑制剂可以下调Id1的表达。本实验又进一步研究了COX-2对Id1在胃癌血管生成作用中的调控。[目的](1)研究Id1与MMPs在胃癌血管生成中的关系及相互作用;(2)探讨在胃癌血管生成中COX-2对Id1的调控。[方法](一)Id1通过调控MMPs发挥促胃癌血管生成的作用:(1)采用免疫组织化学方法检测Id1及MMP-2、-9在胃癌组织中的表达;(2)采用RT-PCR和Western blot方法检测转染Id1特异性小干扰RNA(Id1-siRNA)的SGC7901细胞中MMP-2和MMP-9的表达,并用明胶酶谱实验进一步检测Id1-siRNA细胞中MMP-2、-9的活性;(3)采用免疫组织化学方法检测Id1-siRNA细胞和空载体转染细胞在裸鼠体内成瘤组织中MMP-2、-9的表达;(4)利用MMPs ELISA试剂盒检测不同处理组细胞上清中MMP-2、-9的含量;(5)收集外源性高表达Id1的胃癌细胞培养上清,作为条件培养基培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),利用Transwell小室观察内皮细胞迁移能力和管状形成的情况,再加入MMP-2、-9的中和性抗体,观察其对上述变化的影响;(6)利用双荧光素酶报告基因实验检测在胃癌细胞中抑制Id1后,MMP-2、-9启动子活性的变化。(二)COX-2对Id1在胃癌血管生成作用中的调控:(1)建立高表达COX-2和表达COX-2特异性siRNA的胃癌SGC7901细胞系;(2)通过Western blot和RT-PCR方法检测两种亚细胞系中Id1的表达;(3)采用ELISA方法分析两种细胞上清中VEGF的表达差异;(4)通过MTT实验分析两种细胞亚系的上清对HUVECs体外增殖的影响,并在SGC7901/COX-2中抑制Id1后观察培养上清中VEGF的变化以及对HUVECs增殖的影响;(5)裸鼠成瘤实验观察SGC7901/COX-2/Id1-siRNA转染细胞的成瘤性、肿瘤新生微血管密度(MVD)及Id1的表达。[结果](1)免疫组织化学结果显示,在胃癌组织中Id1和MMP-2、9呈共表达;(2)成功建立表达特异性Id1-siRNA细胞系,Western blot和RT-PCR结果提示不同克隆的转染效率不同;(3)转染Id1-siRNA的SGC7901细胞中MMP-2、-9的蛋白及mRNA表达水平均低于对照组;(4)明胶酶谱实验显示,Id1-siRNA细胞组的MMP-2、-9的活性较对照细胞组下降;(5)Id1– siRNA细胞处理后的裸鼠体内成瘤组织中MMP-2、-9的表达均显著降低;(6)在SGC7901/Id1-siRNA细胞条件培养基中,HUVECs管状形成和增殖能力明显降低,在其中加入MMP-2、-9的中和性抗体后抑制作用被逆转;(7)根据生物信息学网站(http://dbtss.hgc.jp/)提供的启动子序列(-2000~+200),我们克隆了MMP-2、-9的启动子并构建入PGL-3basic报告基因载体,瞬时转染SGC7901细胞和Id1表达降低的SGC7901/Id1-siRNA细胞。可以检测出在Id1表达降低的细胞中,MMP-2、-9的转录活性均降低了2~2.5倍;(8)成功建立高表达COX-2以及表达特异性COX-2-siRNA的稳定克隆,并鉴定了不同克隆的转染效率;(9)高表达COX-2的胃癌SGC7901细胞中Id1的蛋白及mRNA表达水平增高,而转染COX-2-siRNA的SGC7901细胞中Id1的表达则均低于对照组;(10)COX-2高表达的SGC7901/COX-2细胞上清中VEGF的蛋白含量较对照组高,而SGC7901/COX-2-siRNA细胞上清中VEGF的蛋白含量较对照组低;(11)在SGC7901/COX-2细胞条件培养基中,HUVECs生长较对照组加快;在SGC7901/COX-2-siRNA细胞条件培养基中,HUVECs生长较对照组减慢;(12)在SGC7901/COX-2中抑制Id1后,培养上清中VEGF的含量下降,且对HUVECs促进增殖的作用被逆转;(13)裸鼠成瘤试验显示抑制Id1后SGC7901/COX-2细胞成瘤性降低,成瘤组织的微血管密度下降,Id1的表达也下调。[结论](1)Id1和MMP-2、MMP-9在胃癌组织中表达上调;(2)Id1可正性调控MMP-2、-9的表达水平,抑制Id1的表达可减弱MMP-2、-9的表达;(3)Id1通过对MMP-2、-9的正性调控促进内皮细胞体外增殖、迁移和管状形成的能力,并通过激活录促进MMP-2、-9的表达和活性;(4)COX-2可上调SGC7901细胞中Id1的表达,并通过此途径影响内皮细胞的体外增殖能力。本研究提示,在胃癌发生发展中Id1可能通过调控MMP-2、-9的表达及活性促进血管生成,并且在胃癌中高表达的COX-2可能参与调控了Id1介导的促血管生成作用,因此Id1有可能成为胃癌的抗血管治疗的新靶标。