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研究目的1-溴丙烷(1-bromopropane,1-BP)作为一种有机溶剂,自20世纪90年代1-BP逐渐成为消耗臭氧层物质(ozone depleting substance,ODS)如氟利昂类的替代剂。目前中国是1-BP生产及使用大国,使用量和生产量的增加使得1-BP暴露人群逐渐扩大。大量流行病学数据和实验室研究均能显示1-BP暴露能够损伤中枢神经系统(central nervous system,CNS)和周围神经系统(peripheral nervous system,PNS),CNS损伤出现较早。自1999年Sclar报道第1例1-BP职业接触中毒以来国内外不断有职业暴露引起1-BP神经中毒发生,近几年我国1-BP神经中毒病例也逐渐见诸报道。目前1-BP损伤神经系统的机制尚不明确,临床上对于1-BP神经中毒无特效治疗措施。本课题组前期研究观察到,1-BP暴露能够导致实验动物大脑内小胶质细胞明显活化,激活NF-κB信号通路,增加脑内炎性因子和氧化应激产物,导致神经元丢失,实验动物神经行为学异常。但先前研究的实验数据均来自经过较长时间1-BP暴露后的实验动物,在1-BP暴露与CNS损伤的关系中,无法确定脑内炎性反应的起始时间,难以判定与1-BP暴露后神经损伤的因果关系,同时这种神经毒性有机溶剂的暴露是否与目前发病率持续上升的慢性神经退行性病变之间是否存在一定的联系?因此,在该研究中,我们首先分别给予雄性Wistar大鼠不同时间(1d、3d、5d、7d、12d)的1-BP暴露,暴露结束后,观察染毒动物的神经行为学变化,检测实验动物大脑的氧化损伤和炎性指标,分析大脑损伤指标随1-BP暴露时间的变化趋势。以期发现神经炎症、神经功能损伤与暴露时间的相关性,拟对合理安排1-BP接触者劳动时间提供基础数据,并为1-BP神经毒性的有效预防和临床治疗提供线索。核转录因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是介导炎性反应的重要调控因子。在以上实验基础上,我们给予实验动物暴露1-BP同时给予NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)抑制脑内炎性反应,观察了 PDTC对1-BP诱导实验动物的神经行为学损伤和大脑病理学改变的逆转作用,以验证1-BP诱导的大脑炎性反应在1-BP致实验动物CNS毒性中的作用,初步探讨1-BP诱导神经毒性对实验动物大脑中β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)水平的影响,为环境神经毒物与慢性神经退行性病变的相关性提供基础数据。研究方法1 1-溴丙烷诱导大鼠大脑神经损害的剂量效应关系72只体质量为220～240 g的SPF级雄性Wistar大鼠适应性喂养5d后,随机分为对照组,1-BP染毒1d组、3d组、5d组、7d组和12d组(以下简称con、1d、3d、5d、7d和12d组),每组12只。各组动物分别于不同起始时间染毒,12d、7d、5d、3d和1d组动物的开始染毒时间分别为第1d、6d、8d、10d和12d。1-BP采用玉米油稀释,经口染毒,染毒剂量为800mg/kg.bw。对照组和其它组不染毒期间给予等体积玉米油。自实验第13d,每组随机取10只动物采用Morris水迷宫进行连续5d的定位航行实验和1d的空间探索实验评价动物的学习和记忆能力。实验期间动物自由摄食及饮水。水迷宫实验结束后次日,每组随机取8只动物断头处死,留取血液,并在冰上迅速剥离大脑,经液氮速冻后置于-80℃冰箱待后续指标检测。每组剩余4只大鼠进行心脏灌注固定,取大脑制备冰冻切片采用免疫组化观察了大脑小胶质细胞、星形胶质细胞的激活情况,以及神经元的丢失情况;制备脑组织匀浆,采用生化法检测了大脑中一氧化氮(nitric oxide,NO)含量水平、诱导型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase,iNOS)活性;采用荧光法检测了大脑中活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量;western blot检测了大脑炎性相关蛋白、Aβ及其主要降解酶-胰岛素降解酶(insulin degradation enzyme,IDE)的表达情况。2 PDTC干预对1-溴丙烷诱导神经损害的逆转作用50只体质量为220～240 g的SPF级雄性Wistar大鼠适应性喂养5d后,随机分为对照组、1-BP染毒7d天组、1-BP染毒12d组、1-BP染毒7d+PDTC组和 1-BP 染毒 12d+PDTC 组(以下简称 con、7d、12d、7d+PDTC 和 12d+PDTC组),每组10只,各组动物分别于不同起始时间染毒,1-BP暴露12d和7d组动物的开始染毒时间分别为第1d和6d。1-BP采用玉米油稀释,经口染毒,染毒剂量为800mg/kg.bw。对照组和其它不染毒期间给予等体积玉米油。染毒动物给予1-BP后30min经腹腔注射给予1OOmg/kg·bw的PDTC,注射体积为5ml/kg.bw,其余动物注射等体积的生理盐水。自实验第13d,采用Morris水迷宫进行连续5d的定位航行实验和1d的空间探索实验评价动物的学习和记忆能力。水迷宫实验结束后次日随机选取6只动物断头处死,留取血液,并在冰上迅速剥离大脑,液氮速冻后置于-80℃冰箱待后续实验检测。每组剩余4只大鼠进行心脏灌注,取大脑制备冰冻切片进行病理形态学观察。实验期间动物自由摄食及饮水。检测指标及方法同上。统计学方法数据均以(?)±s表示,采用SPSS20.0软件首先进行方差齐性检验,然后进行单因素方差分析及两两比较、卡方检验。与对照组相比,P<0.05认为差异具有统计学意义。研究结果1 1-溴丙烷诱导大鼠大脑神经损害的剂量效应关系1.1 1-溴丙烷染毒不同时间对大鼠神经行为学的影响Morris水迷宫试验结果显示,大鼠游泳总路程、逃避潜伏期随1-BP染毒时间延长逐渐增加,与对照组相比,7d、12d组游泳总路程和逃避潜伏期具有统计学差异(P<0.05)。穿越平台次数以及目标象限时间/总时间随1-BP染毒时间延长逐渐减小,与对照组相比,12d组穿越平台次数和目标象限时间/总时间减少具有统计学差异(P<0.05)。上述结果提示暴露1-BP能够损伤学习记忆能力,且具有时间依赖性。Morris水迷宫实验结果显示各组大鼠游泳平均速度无明显差异(P>0.05),排除了因大鼠行动不便而引起的混杂干扰。1.2 1-BP对大脑胶质细胞激活和NLRP3炎性小体形成的影响实验观察到,1-BP暴露1天,大鼠大脑内的小胶质细胞即可被激活,随染毒时间延长,小胶质细胞激活越明显。1-BP染毒5d、7d、12d组大鼠大脑前额叶皮层可观察到“阿米巴样”小胶质细胞。检测显示,M1型小胶质细胞特异性标志物iNOS随1-BP染毒时间延长表达明显增多(P<0.05),M2型小胶质细胞特异型标志物Arg1随1-BP染毒时间延长表达也略有增加(P>0.05)。1-BP暴露后大鼠脑内星形胶质细胞也被激活,并随1-BP染毒时间延长细胞活化越明显,染毒长的大鼠脑内可观察到星形胶质斑。对炎性小体的检测发现,caspase 1活化、成熟IL-1β和NLRP3均随1-BP染毒时间延长表达增加(P<0.05)。上述结果提示1-BP染毒能够刺激小胶质细胞M1极化,同时伴随星形胶质细胞明显活化。1.3 1-溴丙烷染毒不同时间对大脑氧化和氮化指标的影响与对照组相比,1-BP染毒组大鼠大脑前额叶皮层和海马中ROS含量随染毒时间延长明显升高,呈时间依赖性,其中7d和12d组大鼠前额叶皮质区和海马区ROS含量明显高于对照组(P<0.05);与对照组相比,1-BP染毒组大鼠前额叶皮层和海马NO含量随染毒时间延长明显升高(P<0.05),iNOS活性升高(P<0.05),呈时间依赖性,其中7d和12d组大鼠前额叶皮层和海马区NO含量降低具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,1-BP染毒组大脑前额叶皮质区和海马区氧化修饰蛋白MDA表达增加(P<0.05)。上述结果提示1-BP暴露能够导致机体产生氧化和氮化应激。1.4 1-溴丙烷染毒不同时间对大脑A20及NF-κ B激活的影响与对照组相比,1-BP染毒7d、12d组大脑前额叶皮质胞浆内NF-κB含量增加、核转位增强(P<0.05),且伴随NF-κB信号通路抑制蛋白A20表达明显降低(P<0.05),提示1-BP能够通过减弱锌指蛋白A20对NF-κB信号通路的抑制作用,加剧氧化失衡和脑内神经炎症。1.5 1-溴丙烷染毒不同时间对大脑神经元的影响神经元核蛋白(neuronal nuclei,NeuN)是神经元特异的核蛋白,采用抗NeuN抗体进行免疫组化染色,结果显示,与对照组相比,1-BP染毒后可导致大脑前额叶皮层神经元减少,随染毒时间延长,神经元丢失越明显。Western blot结果显示,第3d起,大脑皮层NeuN表达开始减少,随染毒延长,NeuN蛋白降低加重,其中1-BP染毒5d、7d和12d组与对照组相比,NeuN表达降低差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01),与形态学检测结果变化一致。上述结果提示,随1-BP暴露时间延长,神经元损伤并丢失。2 PDTC干预对1-溴丙烷诱导神经损害的逆转作用2.1 PDTC干预对1-溴丙烷诱导大脑胶质细胞激活的影响与对照组相比,1-BP暴露7d、12d后,大脑前额叶皮质小胶质细胞和星形胶质细胞明显活化,神经元数目均明显减少(P<0.05);同时给予PDTC干预,两个染毒时间点的大鼠大脑中活化小胶质细胞均明显减少(P<0.05),星形胶质细胞活化也被明显抑制,炎性因子分泌减少,神经元数目增加(P<0.05),伴随NF-κB抑制蛋白A20的表达降低的逆转。结果提示1-BP诱导大脑炎性反应与神经元丢失和神经功能障碍密切相关。2.2 PDTC干预对1-BP减弱大脑β淀粉样蛋白降解的逆转作用与对照组相比,1-BP染毒12d组Aβ表达明显增加(P<0.05);与1-BP染毒12d组相比,1-BP+PDTC 12d组Aβ表达减少(P<0.05)。与对照组相比,1-BP染毒12d组IDE表达明显减少(P<0.05),与1-BP染毒12d组相比;1-BP+PDTC 12d组IDE表达升高(P<0.05),表明PDTC干预可明显逆转1-BP引起的IDE减少,推测PDTC干预后能够增加IDE对Aβ的降解。2.3 PDTC干预对大脑A20蛋白表达影响与对照组相比,1-BP染毒7d、12d组NFκB活性抑制蛋白A20表达均明显减少(P<0.05);给予PDTC干预,与1-BP染毒组相比,A20表达均减少(P<0.05),表明PDTC干预可明显增加NFκB活性抑制蛋白A20表达,抑制NF-κB活性,在一定程度上减弱脑内炎性反应。结论1.1-BP暴露能够损伤大鼠的学习记忆能力,神经损伤与1-BP暴露有时间依赖性。2.1-BP能够导致大鼠脑内NF-κB信号传导通路激活,小胶质细胞及星形胶质细胞活化、脑内氧化/氮化应激,导致神经元炎性损伤。3.1-BP暴露可导致大鼠脑内Aβ积聚,与1-BP的暴露时间相关。4.抑制NF-κB,可缓解脑内炎性反应,降低脑内Aβ水平,保护神经元,改善大鼠学习记忆能力。