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背景子宫颈癌是全球女性中常见的恶性肿瘤之一。目前治疗宫颈癌方法主要包括手术和放化疗,但都未达到理想的治疗效果,尤其是宫颈癌中晚期患者,预后较差。p53作为一种最常见的抑癌基因,在肿瘤的发生发展中起重要作用,由于其在子宫颈癌组织中表达水平较低,使得p53基因在子宫颈癌的基因治疗方面有着重要的潜力。因此,利用转入技术将高表达抑癌基因p53结合传统化疗方法极有可能在宫颈癌的治疗中具有广泛的应用价值。羟喜树碱(hydroxycamptothecin,HCPT)作为一种植物类抗癌药物已广泛应用于胃癌、肝癌、骨肉瘤等许多恶性肿瘤的治疗中,疗效较好,但羟喜树碱对宫颈癌的抑制作用研究较少。如果将两者结合,可能会明显提高宫颈癌的治疗效率,从而为临床上宫颈癌的治疗提供新的研究方向。目的将外源野生型p53基因导入宫颈癌HeLa、SiHa细胞中,探讨HCPT对已经转染外源野生型p53基因的宫颈癌细胞体外生长、凋亡作用的影响。方法1.细胞培养常规将宫颈癌HeLa、SiHa细胞复苏和培养。2.转染将宫颈癌细胞分为3组:(1)空白对照组,即正常培养的宫颈癌HeLa、SiHa细胞;(2)阴性对照组,即将空质粒导入宫颈癌HeLa、SiHa细胞;(3)实验组,即将携带外源野生型p53基因的质粒导入宫颈癌HeLa、SiHa细胞。3.检测转染效率将转染过的两组细胞培养48h后,采用荧光显微镜通过蓝光激发绿光来观察转染效率。然后提取总RNA,并采用qRT-PCR检测两种细胞中p53的表达水平,以hACTB基因为内参,来验证p53基因转染效率的高低。4.将HCPT加入各组细胞后,检测宫颈癌细胞增殖率、凋亡率、及相关蛋白的表达量(1)采用CCK-8法检测p53基因真核载体及阴性对照瞬时转染HeLa、SiHa细胞后,用不同浓度的HCPT处理转染后的各组细胞,未转染正常细胞作为对照。(2)采用流式细胞技术检测其对细胞凋亡率的变化。(3)应用qRT-PCR法检测p53、bax、bcl-2、MMP9、VEGF mRNA的表达。(4)应用Western blot检测p53、bax、bcl-2、MMP9、VEGF蛋白相对表达量。结果1.荧光显微镜和qRT-PCR检测显示:导入宫颈癌中的p53目的质粒转染效率高,且转染后p53 mRNA表达水平显著提高。2.CCK-8结果显示:不同浓度HCPT处理转染后宫颈癌HeLa、SiHa细胞,两种细胞抑制率会随着HCPT浓度增加及作用时间的延长而增强,与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),说明HCPT可抑制宫颈癌HeLa、SiHa细胞的增殖,且呈浓度和时间剂量依赖性。3.流式细胞技术结果显示:HCPT组、p53组、p53联合HCPT组与空白对照组比较,细胞凋亡率明显增加,各组间两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.qRT-PCR结果显示:在转染后的宫颈癌Hela、SiHa细胞中p53及bax mRNA表达是增高的,而bcl-2、VEGF mRNA表达是降低的,具有统计学意义(P<0.05)。5.Western-blot结果显示:在宫颈癌Hela、SiHa细胞中p53及bax蛋白的相对表达量均增高,而bcl-2、VEGF的相对表达量是降低的,具有统计学意义(P<0.05)。结论外源野生型p53基因导入宫颈癌HeLa和SiHa细胞后,可明显增强HCPT的作用,即抑制宫颈癌细胞的增殖,促进细胞的凋亡,减少细胞生长的作用。