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抗生素曾挽救了无数生命,但其滥用引发的一系列“细菌耐药性”、“超级耐药菌”、“DNA污染”等问题十分严峻,已对全球生物安全造成巨大威胁,加之减抗、禁抗政策的实行,寻找抗生素替代物、研究新型抗感染药物势在必行。抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）是生物天然免疫的重要活性分子,易降解、耐酸、耐碱、耐高温,不易使细菌等产生耐药性的特点使其有望成为抗生素的替代品。死亡素thanatin源自刺肩蝽（Podisus maciventris）,是从其血液淋巴中分离获得的含21个氨基酸的小分子抗菌肽,具有广谱抗菌活性,但对金黄色葡萄球菌的抗性较低;斑点叉尾鮰（Ietalurus punetaus）属低等鱼类,且底栖生活,生活环境复杂,易遭受病原微生物侵染,β-防御素在其中发挥了重要的免疫作用。本研究选定死亡素thanatin基因和斑点叉尾鮰β-防御素基因（命名为defbl）,进行毕赤酵母偏好性密码子的优化后,基因序列两端添加Eco R I、Sal I酶切位点、6×His标签、终止密码子等,构建单基因组及用T2A剪切肽连接的共表达组（命名为TD）至p MD19-T载体上;后将目的基因片段亚克隆至酵母表达载体pPICZɑA上,经Zeocin抗性筛选、PCR、双酶切验证及测序验证,成功获得含目的基因的真核表达载体pPICZɑA-thanatin、pPICZɑA-defbl、pPICZɑA-TD。重组载体经Sac I线性化处理后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过Zeocin、PCR筛选出可耐受1 000μg/m L Zeocin的重组高抗阳性转化子菌株GS115-pPICZɑA-thanatin、GS115-pPICZɑA-defbl、GS115-pPICZɑA-TD（Mut+）。利用0.5%甲醇诱导目的蛋白的表达,收集培养基上清,冻干浓缩并纯化后进行Western blotting检测,同时收集甲醇诱导0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h的蛋白样品用于后续分析。结果显示:在0.5%甲醇诱导下,目的蛋白在培养基上清中得到表达,thanatin组和dbfel组分别在2.3 k Da和7.8 k Da处出现特异性条带,TD组同时出现上述两条带,蛋白大小均与预期相符,纯化后测得thanatin、dbfel和TD组蛋白浓度分别为600μg/m L,300μg/m L和700μg/m L;最佳表达时间分别为:thanatin组72 h,defbl组96 h,TD组96 h。扩大培养收集纯化各重组蛋白进行体外抑菌实验、溶血性试验,结果显示:1.各重组蛋白对试验选用的八种指示菌株包括革兰氏阴性细菌:大肠杆菌K88、奇变形杆菌、肺炎克雷伯菌ATCC700603、多杀性巴氏杆菌;革兰氏阳性细菌:表皮葡萄球菌ATCC 12228、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26001、停乳链球菌、无乳链球菌均有抑菌作用,thanatin组重组蛋白对多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌的抑菌效果优于对停乳链球菌、无乳链球菌以及金黄色葡萄球菌的抑制效果,抑菌率均在80%到95%之间;defbl组重组蛋对各菌株的抑菌率均在90%以上,TD组重组蛋白对肺炎克雷伯菌的抑制效果最好,MIC值为25μg/m L,显著优于thanatin组和defbl组,对金黄色葡萄球菌的抑制效果显著优于thanatin组,对所有菌株的抑制作用均不差于单基因组;2.各重组蛋白在300μg/m L浓度下的溶血率均低于5%,表明本试验所获重组抗菌肽不具备红细胞溶血性。纯化各重组蛋白以最高浓度150μg/m L作用于HEK293细胞12 h、24 h和36 h,CCK-8法分析各组细胞活力结果显示:各重组蛋白作用于HEK293细胞的36 h内,对HEK293细胞均不产生细胞毒性作用;36 h的DAPI染色结果也表明各重组蛋白均不导致细胞凋亡。综上,本试验成功构建了含死亡素thanatin基因和斑点叉尾鮰β-防御素基因及二者共表达基因的重组表达载体,且经酵母表达系统成功获得了目的抗菌肽蛋白,对试验菌株均表现出良好的抑菌活性,不具有红细胞溶血性,不具有细胞毒性作用,不导致细胞凋亡,具有良好的安全性。相较而言,共表达组重组蛋白抑菌效果更优,更具研究价值,本试验为后续对该蛋白的功能和应用研究提供理论和试验基础,为预防和治疗细菌性疾病提供新的思路方法。