论文部分内容阅读
背景和目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC),是世界上最常见的恶性肿瘤之,在我国,每年约有300,000人死于HCC,约占全世界HCC年死亡总数的50%。HCC的发生是一个涉及多基因改变的复杂过程,已有研究证实,在HCC发生过程中存在着多种抑癌基因启动子区CpG岛的高甲基化现象,干扰抑癌基因的转录,导致细胞异常增殖,引起细胞癌变。经典的Wnt/β-catenin信号转导通路的异常激活与包括HCC在内的多种肿瘤的形成相关。作为该途径的负性调控因子,AXIN2基因在结肠癌,肺癌等恶性肿瘤中存在启动子高甲基化所致表达缺失或下调,最终导致Wnt/(3-catenin信号通路异常激活并引起相应肿瘤的发生,但在HCC中是否存在AXIN2基因启动子甲基化异常尚不完全确定。本研究检测了AXIN2基因在肝癌细胞系和HCC组织中mRNA表达情况及启动子区甲基化状态,初步分析AXIN2基因甲基化水平对mRNA表达的影响,探讨AXIN2基因异常甲基化在HCC发生、发展中的意义。材料与方法收集53例河南省肿瘤医院2009年5月至2010年4月手术切除的HCC和相应的癌旁(距离癌组织大于2 cm)组织标本。所有患者均有肝硬化背景,多数(48/53)为乙肝病毒感染,其中男性48例,女性5例,年龄35-76岁,中位年龄52岁。参照2010巴塞罗那BCLC分期法：A期16例,B期4例,C期33例,D期0例。所有患者均签署知情同意书,均为第1次手术,术前均未实施化疗和其他治疗。正常对照17例,为因肝海绵状血管瘤手术切除的正常肝脏组织标本。所有标本均获得病理证实。5株人肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、Skhep-1、Hep3B、PLC/PRF/5和1株正常肝细胞系L02,由北京大学医学部病原生物学系微生物学教研室提供。用Trizol (Sigma公司)法提取组织细胞总RNA,分光光度计检测抽提的质量和浓度；再按照Fermentas逆转录试剂说明书操作步骤合成cDNA。荧光定量RT-PCR检测AXIN2基因mRNA在细胞系和40例配对肝癌组织中的表达。提取组织细胞DNA,荧光定量PCR检测细胞系和53例配对肝癌组织中AXIN2基因启动子区甲基化水平。数据经SPSS17.0进行Wilcoxon符号秩和检验、t检验、Fisher确切概率法和Spearman秩相关检验的统计学处理,以α=0.05为检验水准。结果1. AXIN2 mRNA在40例HCC和配对癌旁组织中均有表达。AXIN2基因在癌组织中的mRNA表达水平(0.1629±0.06791)低于癌旁组织(0.4155±0.23304),且具有统计学意义(Z=-2.567,P=0.010)。2. AXIN2基因在HepG2、SMMC-7721、Skhep-1、Hep3B、PLC/PRF/5等5种人肝癌细胞系中的甲基化水平分别为：98.15%、98.38%、96.00%、93.14%、83.27%,均明显高于正常肝细胞系L02的甲基化水平7.38%。3.53例HCC组织及配对癌旁组织的AXIN2基因甲基化水平均明显高于正常组织(t=-3.663, P=0.009; t=-4.591, P=0.007), HCC组织与配对癌旁组织之间甲基化水平无明显差异。4. AXIN2 mRNA表达水平与甲基化状态呈负相关(r=-0.458, P=0.032); AXIN2基因高甲基化率低于AXIN2 mRNA低表达率。5.AXIN2基因在BCLC C期HCC患者中的甲基化水平明显高于BCLC A/B期的HCC患者(t=-2.830,P=0.008)。与患者的年龄、性别、HBV是否感染、甲胎蛋白浓度和门静脉是否有癌栓均无关。结论1.肝细胞癌中,AXIN2基因mRNA表达下调,其表达下调的主要机制是该基因启动子区的异常高甲基化；2.肝细胞癌中,AXIN2基因启动子区高甲基化与患者BCLC分期呈正相关。