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第一部分血清外泌体提取和鉴定目的:建立血清中外泌体的提取方法,并对提取产物中的外泌体进行鉴定。方法:研究对象为临床收集的新发乳腺肿块病人66例,其中良性病患者18例,乳腺癌患者48例,并收集同期健康体检者17例作为健康对照。1建立血清外泌体提取方法,并在健康对照组、良性病组、乳腺癌组中分别取样本应用该方法提取外泌体。2利用透射电子显微镜观察提取产物中的外泌体形态。3应用western blot技术检测受试对象血清外泌体特异表面标记蛋白CD9。结果:建立以聚乙二醇8000的50%PBS-NaCl溶液提取血清外泌体的实验方法;电镜观察提取产物中包含典外泌体,为杯托样结构,直径100 nm左右;Western blot检测提取产物高表达外泌体特异表面标记蛋白CD9。第二部分血清外泌体GPC-1水平在乳腺癌诊断中的应用价值目的:检测健康对照、乳腺良性病患者、乳腺癌患者血清外泌体膜蛋白GPC-1含量,并探讨其在乳腺癌诊断中的应用价值。方法:1应用Western blot技术检测受试对象血清外泌体膜蛋白GPC-1的表达量,比较其表达水平在健康对照组、乳腺良性病组、乳腺癌组间有无差异。2以病理诊断结果为金标准,比较血清学肿瘤标志物、B超检查、钼靶射线检查、血清外泌体膜蛋白GPC-1表达水平诊断乳腺癌的应用价值。结果:1.GPC-1在健康对照组表达水平为(中位数0.635,四分位数间距0.145),在良性病组中表达水平为(0.661,0.169),乳腺癌组为(1.065,0.501)。采用Kruskal-Wallis H检验比较,发现三组GPC-1表达水平不全相同(H=32.051,P<0.05),其中乳腺癌组明显高于健康对照组和良性病组。乳腺癌组病人治疗前GPC-1水平与肿瘤分期存在正相关关系(r_s=0.536,P<0.05),表明肿瘤分期越晚,GPC-1含量越高;在GPC-1阳性和阴性病人中,肿瘤分期、淋巴结转移、Ki-67表达差异有统计学意义,GPC-1阳性的病人肿瘤分期往往较晚,易出现淋巴结转移,Ki-67高表达;乳腺癌组病人治疗后GPC-1水平为(中位数0.844,四分位数间距0.195),用Wilcoxon符号秩和检验比较治疗前后乳腺癌组GPC-1表达水平,发现治疗前后GPC-水平有差异(Z=856.0,P=0.006),且治疗后GPC-1水平下降。2.绘制GPC-1表达水平诊断乳腺癌的ROC曲线,可得诊断界值为0.961,诊断乳腺癌的敏感度为72.9%,特异度为97.1%,曲线下面积为0.900(95%CI:0.833-0.967)。血清学肿瘤标志物检测的敏感度为22.9%(11/48),特异度为94.4%(17/18),Kappa值为0.107;B超检查的敏感度为97.9%(47/48),特异度为16.7%(3/18),Kappa值0.193;钼靶射线检查的敏感度为91.7%(44/48),特异度为27.8%(5/18),Kappa值0.230;血清GPC-1检测的敏感度为66.7%(32/48),特异度为94.4%(17/18),Kappa值0.485。结论:1.聚乙二醇8000沉淀法能够从血清中提取出典型外泌体,可用于后续实验。2.乳腺癌病血清外泌体膜蛋白GPC-1表达水平高于健康对照和乳腺良性病组,含量与肿瘤分期正相关,且治疗后水平下降;GPC-1阳性患者较GPC-1阴性患者易出现淋巴结转移,临床分期较晚,肿瘤细胞增殖程度较高。3.血清外泌体膜蛋白GPC-1水平诊断乳腺癌的敏感度和特异度均较高,一致性较好,对乳腺癌的诊断有潜在应用价值。