论文部分内容阅读
恶性肿瘤是现阶段导致人类因病致死的主要原因之一。基于分子水平的肿瘤诊断及治疗方法对于患者的生存时间有着重要的意义。目前市售药物超过40%都是疏水性分子,并且随着组合化学与高通量筛选技术的发展,将会有越来越多的疏水性药物候选分子。核酸适配体是一类通过配体系统进化（SELEX）技术获得的寡核苷酸,可以特异性识别离子、小分子、蛋白、细胞甚至组织等,已广泛用于生物传感、分子检测及药物运输等诸多领域。核酸适配体因为其核酸的化学本质,可以通过化学方法人工合成,具有良好的水溶性,耐有机溶剂,对温度不敏感,且无免疫原性,分子量小,组织渗透能力强。因此,本文将核酸适配体与疏水性小分子（造影剂、药物分子、光敏剂）通过共价或非共价的方式结合,以提高这些疏水性小分子在水溶液中的溶解度和稳定性,用于肿瘤细胞的选择性杀伤以及特定肿瘤组织的成像。本文的研究内容包括:一、肿瘤转移是肿瘤导致病人死亡的主要原因,循环肿瘤细胞（CTC）是从实体瘤进入循环系统发展为转移瘤的细胞起源。为此我们提出了“CTC触发的抗肿瘤药物释放系统”:我们设想首先在进行肿瘤切除手术时,在肿瘤附近的主要血管处放置药物支架,上面修饰了光敏剂标记的发夹型开关式核酸适配体探针（HSA）;当CTC流过时与支架表面修饰的核酸适配体结合,引发其构型发生变化,从而将核酸适配体从支架上带走;CTC与HSA的复合物流经皮肤浅表血管时受到光照（如日光）,被光敏剂产生的1O2杀伤,从而实现抑制肿瘤转移的目的。该系统的关键是药物的结合与细胞的杀伤不在同一位置进行,支架可以放置于体内避光处,没有CTC时光敏剂不会被激活,同时1O2有限的杀伤时间及半径,避免了对非目标细胞的副作用。作为概念性的证明,我们设计了一个由两部分组成的微流控装置来模拟这个过程:第一部分是放在暗处的微流控芯片,芯片通道表面修饰了HSA,用于模拟药物支架;第二部分是一段被LED光源照射的透明毛细管,用于模拟皮肤浅表血管。目标细胞流过微流控装置时,首先在暗处与HSA结合,然后携带HSA进入透明毛细管;光照下HSA上的光敏剂被激活产生1O2,从而使CTC凋亡。这种特异性杀伤CTC的新策略有可能用于跟踪特定的肿瘤细胞、抑制肿瘤转移,实现精准治疗。二、基于上一个工作的CTC刺激药物释放的策略,为了进一步提高药物装载量及对CTC的杀伤能力,我们采用DNA四面体结构结合发夹型开关式核酸适配体探针（HSA）构建了“传感-诊断”一体的DNA纳米装置。我们在DNA四面体的棱上嵌入化疗药物阿霉素,同时在四面体的顶点结合光敏剂,实现了光动力学治疗与化疗的协同治疗。此DNA纳米装置可以感受到CTC的存在且能对其进行特异性杀伤。DNA纳米装置提高了药物装载量,实现了协同治疗,并且促进了细胞对药物的内吞作用。此“传感-诊断”一体的DNA纳米装置,有望进一步提高本地化药物运输策略对于肿瘤转移的抑制作用。随着DNA纳米结构的发展,也有越来越多的DNA纳米结构可以用于发展“传感-诊断”一体的DNA纳米装置。三、荧光成像具有速度快、分辨率高的优点,正电子发射断层扫描（PET）具有灵敏度高、组织穿透性强的优点,两种成像方式结合可以在成像时间及空间上互补,因此我们发展了一种基于核酸适配体的近红外荧光与PET结合的双模成像方法。首先合成了近红外荧光染料Bodipy-636,将其共价偶联于核酸适配体;然后再利用同位素交换法进行18F标记,从而获得了具有近红外荧光与PET双模成像能力的靶向探针。由于18F标记一般需要在有机相中进行以避免氢键的干扰,而DNA却无法溶解于有机溶剂,因此我们在放射标记中引入了基于CPG（可控孔径玻璃微球）的DNA链置换反应以解决这一问题,同时还缩短了实验人员操作放射性同位素的时间。由于分子量较小的核酸适配体可以快速循环至肿瘤部分,利用此[18F]Bodipy-636标记的核酸适配体实现了肿瘤组织的近红外荧光与PET双模成像。我们的方法有望弥补现阶段18F标记的抗体不适合PET成像的缺陷,具有较强的临床转化价值。四、前三个研究工作均是通过共价交联的方法将疏水性小分子偶联于核酸适配体上。我们推测核酸适配体通过分子识别以非共价键的模式与疏水性小分子结合,也可以提高其在水相的溶解度及稳定性。因此,我们以多西紫杉醇作为疏水性药物的模式分子,将前期筛选获得的100个碱基长的核酸适配体DOC6-100mer优化至22个碱基长的DOC6-22mer,且保持了对多西紫杉醇的高亲和力与高特异性;同时通过质谱法验证了核酸适配体-多西紫杉醇复合物,通过圆二色谱表征了多西紫杉醇与优化后的核酸适配体结合可以引起核酸适配体构型的变化;最后,在不借助有机溶剂等增溶剂的情况下,通过加入DOC6-22mer即可将水溶液中多西紫杉醇的浓度提高一个数量级（从14?M提高至145?M）,且核酸适配体不会影响多西紫杉醇的抑制细胞增殖的能力。这一通过核酸适配体提高难溶性药物溶解度的方法也有望推广应用于其他疏水性小分子药物。五、基于上一个工作的研究结果,为了进一步提高多西紫杉醇在水相中的浓度,同时降低核酸适配体的用量,我们基于微流控芯片制备了核酸适配体稳定的多西紫杉醇纳米颗粒。首先利用反相高效液相色谱法对多西紫杉醇的六十条候选核酸适配体序列进行了快速考察,并从中选取了结合能力较高的11条序列进一步进行了质谱表征,在其中六条的质谱上观察到了核酸适配体-多西紫杉醇复合物的峰。随后对微流控芯片的结构、流速以及核酸适配体、多西紫杉醇的浓度等参数进行了优化,获得了半径为89.4±4.9 nm的核酸适配体稳定的多西紫杉醇纳米颗粒。此纳米颗粒对于不耐药肿瘤细胞的杀伤能力与游离药物的效果一致;而对于耐药型肿瘤细胞表现出了明显优于游离药物的杀伤能力,即逆转了耐药细胞株的耐药特性。在这里,核酸适配体既是药物的载体也是纳米颗粒的稳定剂,结合微流控技术即可方便地提高疏水性药物在水相中的浓度,避免了对药物进行修饰。