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在关节外科领域,关节软骨损伤是一直是研究的重点之一,目前尚无有效的治疗方法。由于关节软骨本身无神经支配、缺乏血液供应、软骨细胞增殖和迁移能力较低等独特的组织学特点,自我修复能力有限,易导致不可逆性损害和功能障碍。临床上常用软骨下骨板钻孔或微骨折等技术,使髓腔内未分化的骨髓间充质干细胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)迁移到损伤部位,并通过增殖、分化形成类透明软骨组织,尽管远期效果尚不理想,但提示通过一定的方法,关节软骨组织具有一定修复能力。因此提高BMSCs定向分化为软骨细胞的能力,将有助于关节软骨损伤的修复。近期研究表明,低强度脉冲超声(Low Intensity Pulsed Ultrasound, LIPU)能促进骨折、骨不连的愈合以及促进BMSCs向关节软骨细胞分化并分泌软骨细胞外特有的细胞外基质.通过分子学及基因学研究提示,可能于LIPU的力学和热学作用有关,而且不同培养环境和不同条件的LIPU作用后,得出的结论亦不同。LIPU在关节软骨损伤后的修复作用及具体机制方面的研究尚不完善,距离有效的临床应用尚有一定距离。目的：1.体外分离、平面培养扩增,获得大量新西兰兔关节软骨细胞；2.体外分离、平面培养扩增,获得大量新西兰兔BMSCs;3.制备新型的脱细胞脱钙骨基质(Cell-Free Deminerized Bone Matrix, CFDBM),并作为本实验组织工程软骨的三维立体细胞支架,探讨其可行性；4.探讨兔关节软骨细胞及BMSCs在CFDBM内的增殖、分化及分泌细胞外基质情况；5.通过给予实验组一定强度的LIPU刺激,探讨LIPU对兔关节软骨细胞及BMSCs的作用,为下一步的动物实验研究提供参考,为LIPU最终合理地应用于治疗关节软骨损伤奠定一定的实验基础；方法：1.采用机械粉碎结合酶消化法获取兔关节软骨细胞,通过体外平面培养扩增、传代,应用细胞形态学、Ⅱ型胶原免疫组化染色的方法,观察细胞形态及鉴定细胞表型；2.采用全骨髓漂洗法和贴壁筛选法从兔骨髓组织中分离、纯化BMSCs,进行体外平面培养扩增,应用细胞形态学及免疫组化染色的方法,观察细胞形态及鉴定细胞表型；3.新型的方法制备CFDBM,并采用CFDBM复合兔同种异体关节软骨细胞、及BMSCs构建组织工程软骨的三维共培养体系,在相差显微镜下观察细胞的增殖和基质合成分泌情况,通过细胞计数、H-E染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色等方法,观察CFDBM中细胞生物学性状的变化；4.构建BMSCs-软骨细胞-CFDBM三维共培养体系,予以频率为1.0MHz、瞬时空间强度(SATA)为10mW/cm2.刺激时间为每天20min的LIPU刺激,应用石蜡切片HE染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色等方法检测细胞在CFDBM内的形态、生长增殖情况及Ⅱ型胶原合成和分泌情况；结果：1.第1-4代关节软骨细胞及BMSCs与原代细胞的生物学性状相似；2.在CFDBM内,软骨细胞和BMSCs可以保持较高的增殖能力；第1-3代软骨细胞维持其细胞表型稳定；BMSCs与关节软骨细胞共培养,可诱导BMSCs向关节软骨细胞分化,并分泌软骨细胞特有的细胞外基质；3.BMSCs单独种植于CFDBM内,未见有软骨细胞特有的细胞外基质合成和分泌；4.关节软骨细胞单独种植于CFDBM内,可见软骨细胞特有的细胞外基质合成和分泌逐渐减少；5.BMSCs和关节软骨细胞混合植于CFDBM内,可见软骨细胞特有的细胞外基质合成和分泌,较单独种植关节软骨细胞为多；6.频率为1.0MHz、瞬时空间强度(SATA)为10mW/cm2.刺激时间为每天20min的LIPU刺激,不影响BMSCs活性；7. BMSCs和关节软骨细胞混合植于CFDBM内,并给予频率为1.0MHz、瞬时空间强度(SATA)为10mW/cm2、刺激时间为每天20min的LIPU刺激,可见软骨细胞特有的细胞外基质合成和分泌,较无LIPU刺激组为多,但未见明显促进细胞生长和增殖作用。结论：1.CFDBM可作为组织工程软骨的体外研究的细胞支架；2.LIPU能够促进BMSCs向关节软骨细胞分化并维持关节软骨细胞表型的稳定,刺激合成并分泌细胞外基质,但未发现有明显促进细胞增殖的作用。