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急性心肌梗死是目前全世界发病率居高和极为凶险的疾病。溶栓和经皮冠状动脉介入(即及早再灌注)是当前急性心肌梗死最有效的重要治疗方法。然而再灌注疗法在一定程度上诱导的心肌损伤也不容忽视,而目前为止尚无有效的治疗手段。近年的研究发现,组织细胞缺氧时诱导表达的低氧诱导因子-1ɑ(hypoxia inducible factor-1ɑ,HIF-1ɑ)具有抗心肌缺血/再灌注损伤的作用。在含氧量正常的条件下,HIF-1α的脯氨酸残基P564被脯氨酸羟化酶羟基化而降解,只有在缺氧条件下,羟基化被抑制HIF-1ɑ才得以稳定表达。因此,我们前期采用脯氨酸羟化酶(proline hydroxylase,PHD)抑制剂二甲氧乙二酰甘氨酸(dimethyloxalyl glycine,DMOG)来稳定HIF-1ɑ的表达。有研究证实在口腔鳞状癌细胞系(OSCC)中HIF-1ɑ过表达后p-GSK3β蛋白表达水平增高。GSK-3β是一种非常保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,普遍存在于哺乳动物真核细胞中,除了可调控糖原合成酶(GS)的活性外,它还能磷酸化多种底物,包括代谢与信号、结构蛋白和转录因子等,调节细胞的分化、增殖、存活与凋亡。而HIF-1ɑ对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用是否与GSK3β有关未见相关报道。因此,本研究的旨在利用DMOG稳定HIF-1ɑ表达的基础上来探讨这一问题。最近,已经证明GSK-3β信号传导可以抑制线粒体通透性转换孔(mPTP)开放,控制细胞命运。有研究者发现,通过使GSK3β丝氨酸位点(Ser9)磷酸化而导致GSK3β失活,可发挥对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。在正常心肌中,p-GSK3β(Ser9)主要位于胞质溶胶中,但在缺血/再灌注等压力条件下,如大鼠缺血再灌30分钟后,p-GSK3β(Ser9)可能转移到线粒体中对心肌缺血/再灌注发挥作用。但是,GSK-3β介导HIF-1ɑ对心肌缺血再灌后的保护作用是否经线粒体而发挥仍需进一步证实。目的:1.观察HIF-1ɑ对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响是否与GSK-3β有关。2.探讨GSK-3β介导HIF-1ɑ减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤损伤的可能机制。方法:选取8周龄健康雄性清洁级SD大鼠,体重200~250g,将其随机分为5组:(1)假手术组(Sham);(2)心肌缺血/再灌组(I/R);(3)HIF-1稳定剂DMOG+心肌缺血/再灌注组(DMOG+I/R);(4)HIF-1ɑ抑制剂YC-1+I/R组(YC-1+I/R);(5)DMOG+GSK-3β抑制剂SB216763+心肌缺血/再灌注组(DMOG+SB216763+I/R)。按照经典的结扎冠状动脉左前降支法建模,心肌缺血45 min,之后再灌注3 h,留取左心室前壁组织。Western blot法检测心肌组织HIF-1ɑ、总GSK3β和p-GSK3β(Ser9)、UCP3蛋白表达;Real-time PCR法检测VEGF、HO-1、Bcl2、UCP3的mRNA水平;HE染色观察心肌组织损伤情况;免疫组化检测炎性细胞浸润情况;TUNEL染色检测心肌细胞的凋亡。结果:1 DMOG预处理可上调I/R心肌组织中HIF-1ɑ的蛋白表达及其下游因子VEGF、HO-1、Bcl2的mRNA表达与Sham组相比,I/R组HIF-1ɑ的蛋白表达有所升高;与I/R组相比,给予DMOG预处理后,HIF-1ɑ的蛋白表达水平明显升高,而给予HIF-1ɑ抑制剂YC-1之后,HIF-1ɑ的蛋白表达水平显著下降(P<0.05),表明DMOG可以稳定HIF-1ɑ的蛋白表达。与I/R组相比,稳定HIF-1ɑ之后其下游因子VEGF、HO-1、Bcl2的mRNA表达水平均显著升高,而给予HIF-1ɑ抑制剂YC-1后VEGF、HO-1、Bcl2的mRNA表达水平均降低(P<0.05)(见图1,2)。2HIF-1ɑ明显上调I/R心肌组织中p-GSK3β蛋白表达水平各组之间总GSK3β蛋白表达无明显差异,与I/R组相比,DMOG预处理组p-GSK3β蛋白表达水平明显升高,而给予HIF-1ɑ抑制剂YC-1后p-GSK3β蛋白表达水平明显下调(P<0.05)(见图3)。这一结果表明HIF-1ɑ可明显上调I/R心肌组织中p-GSK3β蛋白表达水平。3 HIF-1ɑ通过GSK3β减轻心肌损伤及炎性细胞浸润HE染色结果显示Sham组心肌组织结构正常,纤维束状整齐排列,着色均一。I/R组心肌组织结构明显受损,肌纤维排列紊乱,纹理模糊。而给予DMOG稳定HIF-1ɑ的表达后,心肌组织结构较完整,排列相对整齐。但给予GSK3β抑制剂SB216763后,心肌组织结构破坏,肌纤维排列紊乱(P<0.05)。CD45~+免疫组化结果显示与I/R组相比稳定HIF-1ɑ的表达后,CD45~+白细胞的数量增加,给予GSK3β抑制剂SB216763后CD45~+白细胞的数量减少(P<0.05)(见图4,5)。这些结果表明GSK3β介导HIF-1ɑ减轻大鼠心肌I/R后的心肌损伤以及炎性细胞浸润。4HIF-1ɑ通过GSK3β减轻心肌细胞凋亡TUNEL染色结果发现,与Sham组相比,I/R组心肌细胞凋亡率明显上升,DMOG稳定HIF-1ɑ后心肌细胞凋亡率下降,而给予GSK3β抑制剂SB216763后心肌细胞凋亡率升高(P<0.05)(见图6)。本结果说明GSK3β介导HIF-1ɑ减轻大鼠心肌I/R后的心肌细胞凋亡作用。5 GSK3β介导HIF-1ɑ对心脏的保护作用机制可能与线粒体结构蛋白UCP3有关。与I/R组相比,DMOG预处理组UCP3蛋白表达水平明显升高,而给予GSK3β抑制剂SB216763后UCP3蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。为了进一步验证上述结果,同时检测了UCP3的mRNA表达,结果与上述一致(P<0.05)。见图7。结论:HIF-1ɑ可明显上调p-GSK3β的蛋白表达,而GSK3β抑制剂则逆转了HIF-1ɑ对大鼠I/R损伤的炎性细胞浸润及心肌细胞凋亡的降低效应,而且GSK3β可能介导了HIF-1ɑ上调线粒体内膜蛋白UCP3的蛋白及mRNA表达,表明GSK3β介导HIF-1ɑ对心脏的保护作用,并可能与线粒体结构蛋白UCP3有关。