酪氨酸磷酸化作用驱动的信号转导，调控着细胞增殖和细胞分化，而酪氨酸磷酸化作用的启动、延伸和终止则取决于酪氨酸蛋白激酶(Protein tyrosine kinase，PTK)和酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphoralase，PTPase)的相互作用结果。PTK和PTPase在蛋白质磷酸化和脱磷酸化过程中催化方向相反的反应，这一过程被称为可逆性蛋白质磷酸化。可逆性蛋白质磷酸化是生物体内存在的一种普遍的的调控方式，是影响细胞功能的基本机制，几乎涉及所有生理、病理过程，如细胞的生长发育，基因表达与调控，神经递质的合成与释放，甚至癌变等。尤其是在细胞信号转导过程中，可逆性蛋白磷酸化作用占有极其重要的地位，发挥着调节中枢的作用。PTK和PTPase作为胞内信使的直接或间接作用的靶酶，通过磷酸化和去磷酸化作用控制信号转导途径中其他酶类或蛋白质的活性，使细胞对外界信号产生反应。PTK和PTPase的协调作用，维持着机体功能的正常发挥，否则，机体将发生病理变化，甚至产生癌变等。 PTK在细胞信号转导和细胞增殖中的作用提示，PTK的特异性抑制剂对调控细胞的信号转导，预防和治疗肿瘤具有重要的价值。因而目前从天然药物中筛选PTK抑制剂及合成PTK抑制剂已成为抗肿瘤药物开发的新方向和生长点，而且信号转导分子及PTK已成为药物设计的新的分子靶点。 曲章义：Abl－PTh基因的克隆、表达、纯化及PTK中药抑制剂的筛选 我国拥有丰富的中草药资源，中医药的研究己有千年史，己发现祖 国中药宝库中有几百种具有不同程度的抗肿瘤活性的中药。因而，在我 国开展从中药中筛选天然的PTK抑制剂研究不仅具有得天独厚的有利条 件，而且，这对于中药现代化、中药走向世界及开发拥有我国自主知识 产权的新型抗肿瘤药物等均意义重大。 据此，本文在原核表达系统中克隆并表达了 V－abl PTK基因，获得了重组的 PTK蛋白，进而利用本文建立的PTK活性非放射性检测法，以加l－PTK为指 示剂从30种中药中筛选出了7种对PTK活性具有明显抑制作用的中药，并对其中3 种中药对肿瘤细胞的生长和PTK活性的影响及对荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用进行了 验证性研究，为开发PTK抑制剂类抗肿瘤药物，尤其是开发特异性防治白血病的药 物奠定了基础。 第一部分Abl酪氖区蚤白激酶（PTK基因的克隆 以鼠白血病病毒v－ahl cDNA的PTK基因为模板，PTK基因两侧的特异 序列为引物，用PCR法扩增了长度为860hP的PTK基因。将该基因用Baalll 和ECORI进行双酶切后，定向重组至GST融合蛋白表达载体pGEXZT中， 构建了重组质粒 nGEX－PTK。将重组质粒扯EX－pK转化至感受态 E coil DH5a 中，用含有AInP的LB平板选择阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒，分别用限制 性内切酶酶切法和DNA序列分析法鉴定克隆的正确性。将测序后的外源DNA 序列与GenBank中的v－abl基因（AF033812）进行序列同源性比较证实：所克隆的 外源DNA确是v－abl中的PTK基因，该基因位于AF033812 v－abl6基因的1671～ 2513hp处。用Gene Runner软件对序列分析的结果进行蛋白翻译的分析结果表明， 该PTK基因以正确的阅读框与“T融合蛋白表达载体pGEXZT重组，形成田T－PTK 融合蛋白。 4 浙江大学99级博士学位论文 第二部分 重组酪氢酸蛋白汲酶（PTK）的高效表达和纯化 本部分研究了不同因素对重组酪氨酸蛋白激酶PTK表达效率的 影响，获得了高效表达 PTK的优化方案。用 GST－Senharose 4B亲和层析 柱纯化了GST－PTK融合蛋白。具体结果如下： 1．研究了盯K诱导表达的Time course，发现诱导10min后即可检测 到特异性融合蛋白，4h后达到诱导表达高峰。 2．诱导剂IPTG浓度在0．l－ZmM范围内，对诱导表达效率没有明显的 影响，因而通常倩况下，使用0．ZmM的IPTG即可。 3．培养基营养成分的含量对PTK表达效率有显著影响，加富培养基的 表达效率明显升高。 4．培养温度对诱导表达效率影响显著，通常情况下，宜用30’C“37C 进行诱导表达。 5．初始诱导时间对诱导表达效率有显著影响，以OD6。。＝0．5”0．6开始 诱导为宜。 6．高效诱导表达优化方案： 在SB培养基中，当细菌生长至OD。。。＝0．5时，加入