近年来由食源性致病菌引起的食品安全事件时有发生,严重威胁着我国的社会公共卫生安全,成为制约我国食品相关产业健康发展的突出问题。食源性致病菌的快速筛查对于预防食源性疫情的爆发和控制食源性疾病的扩散具有重要的意义。然而,现有的食源性致病菌检测方法,如传统分离培养鉴定方法、分子生物学方法以及免疫学方法,分别存在检测时间长、样品前处理复杂、灵敏度低等问题,难以满足食品安全风险预警的需求,因此亟需研究开发快速、灵敏、简单的食源性致病菌检测新技术与新装备。生物传感器是一种新兴的生物检测前沿技术,通常具有检测速度快、灵敏度高以及易集成等优点,结合免疫磁分离技术、酶催化反应和微流控技术可以进一步提高传感器的特异性和灵敏性。因此,本文旨在融合生物传感器、免疫磁分离、酶催化放大以及微流控芯片,探索快速、灵敏、简便的食源性致病菌检测方法,为保障食品安全提供病原微生物快速筛查技术支持。具体研究内容主要包括:(1)基于免疫磁分离和脲酶催化的阻抗生物传感器研究:针对实验室前期研究的阻抗生物传感器存在的电极抗体修饰过程繁琐、固相-液相免疫反应效率低以及电极无法重复利用等问题,本文研究开发了一种基于脲酶催化的新型阻抗生物传感器,并以单增李斯特菌为模型进行方法验证和性能评价。首先,利用免疫纳米磁珠对样品中的单增李斯特菌进行特异性分离,获得纯化和富集的磁珠-细菌复合体(磁细菌);然后,利用脲酶修饰的免疫胶体金与磁细菌进行反应,形成磁细菌-胶体金-脲酶复合体(酶细菌);最后,利用酶细菌上的脲酶催化非电解质的尿素产生电解质的铵根离子及碳酸根离子,并利用叉指微电极检测溶液阻抗变化,对目标细菌进行定量分析。实验结果表明:该生物传感器可在2h内实现单增李斯特菌的定量检测,线性检测范围为102-105 CFU/mL;引入脲酶能有效放大阻抗信号,将检测灵敏度提高了约10倍,检测下限为3×102 CFU/mL;因无需在微电极表面进行生物化学修饰,微电极可以重复使用,能有效降低检测成本。但是,该生物传感器检测结果受残留的盐离子影响较大,需要非常严格的背景清洗步骤,增加了操作难度。(2)基于免疫磁分离、脲酶催化和微流控芯片的阻抗生物传感器研究:针对上述生物传感器存在的残留盐离子干扰检测结果的问题,本章研究开发了 一种基于微流控芯片的阻抗生物传感器,并深入研究了阻抗相角的电化学响应规律。首先,利用3D打印技术和等离子体键合技术,分别设计制作了一个用于免疫磁分离的分离芯片以及一个用于阻抗测量的检测芯片;然后,在分离芯片上实现目标细菌的免疫磁分离、胶体金结合、背景清洗和脲酶催化等步骤;最后,利用阻抗幅值和相角,在检测芯片上实现催化产物(铵根离子及碳酸根离子)的阻抗测量。实验结果表明:该生物传感器对单增李斯特菌的线性检测范围为102-105CFU/mL,检测下限为1.6× 102CFU/mL;引入微流控技术,能够加快免疫反应速度,同时提高背景清洗效率,将检测时间缩短到约1h。此外,本研究还发现电化学阻抗相角的响应规律,即相角频谱随催化产物浓度增大朝高频方向平移,并提出了阻抗相角检测细菌的新方法。(3)基于免疫磁分离、脲酶催化和pH指示的光学生物传感器研究:针对上述生物传感器阻抗检测需要复杂仪器设备的问题,本文进一步研究开发了一种基于pH指示的光学生物传感器,并以单增李斯特菌为模型进行方法验证和性能评价。同上所述,先利用免疫磁珠对目标细菌进行分离和富集,再结合脲酶修饰的胶体金形成酶细菌,然后利用脲酶水解尿素产生铵根离子及碳酸根离子,引起溶液的pH值升高,最后利用pH指示剂的颜色变化实现对目标菌的定量分析。通过筛选,本研究选择溴甲酚紫为pH指示剂开展细菌检测实验,结果表明:该生物传感器可在2 h内实现单增李斯特菌的定量检测,线性检测范围为102-106CFU/mL,检测下限为1 × 102CFU/mL。此外,该生物传感器无需使用复杂的仪器设备且结果判读简单,具有现场检测应用的潜力。(4)基于免疫磁分离和微流控颗粒分离的光学生物传感器研究:针对现有多数生物传感器需要依靠配对抗体形成“三明治”结构才能进行目标物分析检测的问题,本研究结合免疫磁分离和酶催化显色,研究开发了一种基于微流控颗粒分离的光学生物传感器,并以沙门氏菌为模型进行方法验证和性能评价。首先,将生物素化抗体与生物素化辣根过氧化物酶(bi-HRP)与链霉亲和素磁珠进行结合,制备了 HRP-磁珠-抗体复合体(酶标磁珠);然后,利用酶标磁珠对样品中的沙门氏菌进行分离和富集,形成酶标磁珠-细菌复合体(酶磁细菌);再利用微流控颗粒分离芯片将酶磁细菌与游离酶标磁珠进行分离;最后,利用酶磁细菌上的HRP酶催化TMB底物改变颜色,并利用吸收光谱测定颜色变化,实现对沙门氏菌的定量分析。本文分别利用2.2μm和150nm的颗粒来模拟酶磁细菌和酶标磁珠开展了颗粒分离参数优化,发现浓度为1%、分子量为360 kD的PVP溶液在0.2-1.4 mL/h流速范围内对2.2 μm的颗粒具有较好的粘弹性聚集效果,且当鞘流流速为1mL/h和颗粒流速为0.1 mL/h时,两者可实现完全分离。细菌检测实验结果表明:该生物传感器可在1.5 h内实现沙门氏菌的定量检测,线性检测范围为103-106 CFU/mmL,检测下限为2 ×103CFU/mL,该生物传感器提供了 一种磁细菌和游离磁珠基于尺寸分离的有效方法,使纳米磁珠作为细菌检测标记物成为可能,避免了生物传感器对配对抗体的依赖性,并缩短了检测时间。