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目的:利用非病毒性的基因传递方法,将编码血管生成素(angiogenin,Ang)的基因引入一种真皮替代物——聚乳酸-聚羟基乙酸编织网强化的胶原壳聚糖真皮支架(polylactic-co-glycolic acid knitted mesh reinforced collagen chitosan dermal scaffold,PLGAm/CCS),构建Ang基因活化真皮支架;通过体外与体内实验,证实其转染效能及介导早期血管化的有效性,揭示Ang功能相关的机制及信号转导通路,为真皮支架早期血管化不足的问题提供新的解决方案,为新型真皮替代物的开发提供理论依据。方法:构建血管生成素质粒DNA并对其进行有效性检测。采用pUCm-T载体构建出可同时表达Ang和强化型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的质粒 DNA(plasmid DNA encoding angiogenin,pAng),同时构建仅表达EGFP 的质粒 DNA(plasmid DNA encoding EGFP,pEGFP)作为对照,并通过基因测序、核酸电泳等方法验证所构建质粒DNA的有效性。在体外研究中,构建Ang基因活化真皮支架并对其进行物理及生物学性能表征。以阳离子载体 N,N,N-三甲基化壳聚糖(N,N,N-trimethyl chitosan chloride,TMC)为非病毒性基因传递载体,构建TMC/pAng复合微粒,并通过透射电镜观察复合微粒的微观形貌特征;将TMC/pAng复合微粒与PLGAm/CCS整合,构建Ang基因活化真皮支架——TMC/pAng-PLGAm/CCS;通过木瓜蛋白酶消化法及荧光光谱仪检测支架上实际的基因负载量,检测该基因活化支架的体外缓释性能及转染率。以相同方法构建TMC/pEGFP-PLGAm/CCS,并构建仅负载裸质粒DNA(pAng)和空白的支架(pAng-PLGAm/CCS和PLGAm/CCS),作为三组对照;将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)按照一定的密度分别接种到灭菌处理后的四种支架上,采用MTT法检测不同支架上HUVEC的增殖情况;采用ELISA试剂盒检测支架上细胞裂解液中Ang含量的变化。在体外研究的基础上,构建不同基因负载量的Ang基因活化真皮支架进行体内研究。以SD大鼠皮下埋植真皮支架的模型,通过组织病理学、免疫组织化学、分子生物学等方法,验证Ang基因活化支架的体内转染效能,评价该支架的促血管化性能,并筛选支架在体内的基因负载量的合理范围。随后,再进行Ang基因活化真皮支架介导全层皮肤缺损创面早期血管化的研究。采用SD大鼠全层皮肤缺损模型,将制备好的四种支架(TMC/pAng-PLGAm/CCS、TMC/pEGFP-PLGAm/CCS、pAng-PLGAm/CCS 和 PLGAm/CCS)分别与聚氨酯薄膜充当的临时性表皮复合之后,移植到全层皮肤缺损创面,定期观察、取材并收集样品,通过组织病理、免疫组织化学、电子显微镜及分子生物学的手段检测支架移植后早期的血管新生及成熟情况,以及Ang可能发挥促血管化作用的主要信号通路中的关键信号蛋白,进一步探讨Ang介导早期血管化的作用机制。结论:(1)本研究成功构建TMC/pAng-PLGAm/CCS真皮支架,体外及体内实验结果表明该基因活化支架具有良好的基因转染效能,能够使真皮支架血管化时间提前至移植术后第5天,今后可能作为新一代的真皮替代物。(2)本研究体内实验结果提示,Ang基因活化支架诱导的促血管化过程可能与Erk1/2通路、α-actinin系统密切相关,并有多种细胞和生物活性因子参与其中,具体机制仍有待进一步证实。