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铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是兰科石斛属草本植物,含有多糖、茋类、联苄类、生物碱类等多种药用成分,具有很高的药用价值、观赏价值和商业价值。多倍体育种是药用植物育种的重要方法,对铁皮石斛多倍体诱导已有许多研究报道,但迄今尚未见到铁皮石斛异源多倍体诱导和多倍化对铁皮石斛组培快繁特性影响的研究报道,也未见到多倍化增加铁皮石斛多糖含量分子机理的研究报道。本研究以铁皮石斛、金钗石斛和兜唇石斛为材料,研究了秋水仙素处理和组织培养相结合诱导铁皮石斛同源多倍体和异源多倍体方法,创建铁皮石斛同源和异源多倍体,在此基础上,研究多倍化对铁皮石斛组培快繁特性的影响以及同源多倍化增加铁皮石斛多糖含量的分子机理。主要结果如下:1.秋水仙碱处理对铁皮石斛品种间杂交后代和种间杂交后代类原球茎存活率有显著影响。总的来说,秋水仙素浓度越高、处理时间越长,类原球茎存活率越低,种内品种间杂交后代类原球茎存活率比种间杂交后代类原球茎存活率高。秋水仙素处理类原球茎诱导多倍体效率与秋水仙素浓度、处理时间和材料有关。在试验的处理时间范围内,0.05 mg·L-1秋水仙素处理未诱导出同源多倍体,但诱导出异源多倍体,异源多倍体诱导率比同源多倍体高。铁皮石斛品种间杂交后代‘201-1’类原球茎在0.1mg.L-1秋水仙素溶液中处理3 d,多倍体诱导率最高,为47.00%,‘201-3’类原球茎在0.15mg.L-1秋水仙碱溶液中处理3 d,多倍体诱导率最高,为48.89%,‘202-7’类原球茎在0.1mg.L-1秋水仙碱溶液中处理5 d,多倍体诱导率最高,为46.67%,‘202-8’类原球茎在0.1mg.L-1秋水仙碱溶液中处理4 d,多倍体诱导率最高,为50.00%。铁皮石斛和金钗石斛杂种后代‘107-6’和‘107-13’以及铁皮石斛和兜唇石斛杂种后代‘200-4’类原球茎在0.1mg.L-1秋水仙素溶液中处理4 d,多倍体诱导率均最高,分别为46.67%、37.17%和55.00%,铁皮石斛和兜唇石斛杂种后代‘200-7’类原球茎在0.05mg.L-1秋水仙碱溶液中处理7 d,多倍体诱导率最高,为50.00%。上述结果表明,铁皮石斛不同材料的多倍体诱导最佳处理方案不完全相同。2.获得铁皮石斛同源四倍体4份、铁皮石斛和金钗石斛异源四倍体2份以及铁皮石斛和兜唇石斛异源四倍体2份。同源多倍体和异源多倍体试管苗形态性状发生了明显的变化,与对应的二倍体相比,四倍体试管苗的茎更短更粗、根更短更粗,单位面积气孔细胞数更少、面积更大。同源四倍体鲜重比二倍体高,而异源四倍体鲜重比二倍体低。3.染色体加倍对铁皮石斛组培快繁特性有显著影响。同源四倍体类原球茎的诱导率均比对应的二倍体高;同源四倍体DO.201-1.T和DO.201-3.T的增殖系数比对应的二倍体高,但同源四倍体DO.202-17.T和DO.202-8.T的增殖系数低于对应的二倍体;同源四倍体DO.201-1.T平均芽分化数比二倍体DO.201-1.D少、平均根分化数相同、鲜重相近,同源四倍体DO.201-3.T平均芽分化数比二倍体DO.201-3.D多、平均根分化数相同、鲜重相近,同源四倍体DO.202-7.T的平均芽分化数比二倍体DO.202-7.D多,鲜重也高;同源四倍体DO.202-8.T的平均芽分化数和鲜重与二倍体DO.201-3.D均没有显著差异。除异源四倍体DON.107-6.T外,其余3个异源四倍体类原球茎的诱导率均比对应的二倍体高;除异源四倍体DON.200-7.T外,其余异源四倍体增殖系数也比对应的二倍体高;异源四倍体DON.107-6.T、DON.200-4.T和DON.200-7.T的平均芽和根分化数均比二倍体少,而DON.107-13.T的平均芽和根分化数均比二倍体多。4.测定了二倍体DO.201-1.D和同源四倍体DO.201-1.T6个月大试管苗根、茎、叶中的多糖含量,结果表明,同源四倍体根、茎、叶中的多糖含量显著高于二倍体,表明,同源多倍化导致铁皮石斛多糖含量的增加。5.利用Illumina Hiseq 2500平台对二倍体DO.201-1.D和同源四倍体DO.201-1.T的类原球茎、芽、四个月大试管苗和6个月大试管苗进行转录组测序,共获得了274403个unigene。二倍体和四倍体类原球茎中的差异表达基因有33428个,其中,表达上调基因数为13446个,显著富集在剪接体、m RNA监视路径、醣酵解/糖异生作用等代谢通路上,表达下调基因数为19982,显著富集在核糖体、氨基酸的生物合成和蛋白质加工内质网代谢通路上。多倍体芽苗和二倍体芽苗中差异表达基因（DEGs）数为13465个,其中上调基因有2164个,主要富集在蛋白质加工内质网、泛素介导的蛋白质分解和氨基酸和核苷酸糖代谢,下调基因有11301个,主要富集在核糖体、蛋白质加工内质网和醣酵解/糖异生作用等代谢途径上。6.采用q RT-PCR分析多糖含量相关基因Do Man2-2、Dog1gc1、Dog1gc3-1、Do PGM1、Do PGM2-2、Doi PGM1-2、Do PMM2-1、Do GMP1-3、Do CSLA3-1、Do CSLA2-1和Do GMPP在同源多倍体和异源多倍体中的表达。结果表明,与对应的二倍体相比,在同源四倍体DO.201-1.T中,Dog1gc1、Dog1gc3-1、Do GMP1-3、Do GMPP,Doi PGM1-2、Do Man2-2、Do PGM2-2和Do CSLA2-1表达显著上调,其余3个基因Do CSLA3-1、Do PGM1和Do PMM2-1表达下调。在同源四倍体DO.201-3.T,DO.202-7.T和DO.202-8.T中,表达显著上调的基因分别为Do CSLA2-1、Dog1gc1、Do PGM2-2和Do PGM1,Do CSLA2-1、Do CSLA3-1、Dog1gc1、Do GMPP、Doi PGM1-2和Do PGM1以及Do CSLA2-1、Dog1gc1、Dog1gc3-1、Do Man2-2和Do PGM1。在异源四倍体DON.107-6.T中,表达显著上调的基因包括Do CSLA2-1,Dog1gc1和Do PMM2-1,其余8个基因表达下调,在异源四倍体DON.107-13.T、DON.200-4.T和DON.200-7.T中,表达上调的基因分别为Do CSLA2-1、Do Man2-2和Do PGM2-2,Do GMPP、Do GMP1-3、Doi PGM1-2、Do PGM1和Do CSLA2-1以及Do CSLA2-1、Do CSLA3-1、Do GMP1-3、Do GMPP、Doi PGM1-2、Do Man2-2、Do PGM1和Do PMM2-1。Do CSLA2-1在四个同源四倍体和4个异源四倍体中表达均显著上调,表明该基因可能与多倍化增加药用石斛多糖含量有关。通过上述研究,建立了铁皮石斛多倍体创建技术体系,获得了4份铁皮石斛同源多倍体和4份异源多倍体资源;明确了染色体加倍对铁皮石斛组培快繁特性的影响,初步阐明了同源多倍化增加铁皮石斛多糖含量的分子机理,为深入研究铁皮石斛多倍化效应及其分子机理,培育多倍体铁皮石斛新品种奠定了坚实的基础。