论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染呈世界性流行,是影响全球的严重公共卫生问题。尽管目前乙型肝炎的发病机制尚未完全明确,但由于HBV并不能直接导致肝细胞病变,研究者们普遍认为机体的病理损伤和病程转归主要与病毒入侵后引发的机体免疫应答有关,针对HBV抗原的免疫应答强度决定了疾病最终的转归[2,引。因此,特异性CD4+/CD8+T细胞应答的检测将有助于评估HBV感染的病理损伤和病程转归。本研究将采用自噬诱导剂处理Huh7.6细胞、HepG2.2.15细胞后,募集含有多种HBV抗原成分的自噬小体(HBV+DRibbles),检测HBV+DRibbles刺激乙肝患者PBMC释放IFN-γ的水平,并探讨其与临床分期和疾病转归的相关性。目的：以含HBV多种抗原的自噬小体(HBV+DRibbles)体外刺激乙肝患者PBMC,探讨：1) HBV+DRibbles是否特异性刺激乙肝患者PBMC并产生细胞因子?；2)HBV+DRibbles刺激乙肝患者PBMC产生细胞因子是否与乙肝患者的临床分期和疾病转归相关?方法：1.制备转染HBV全基因的人肝癌细胞株Huh7.6细胞和HepG2.2.15细胞释放的自噬小体(DRibbles)。2. Western Blot检测HBV+DRibbles的LC3I/II蛋白、透射电镜检测自噬小体的亚细胞结构、ELISA及化学发光法检测自噬小体中HBsAg和HBeAg的含量。3. ELISA检测HBV+DRibbles刺激不同临床分期乙肝患者PBMC产生IFN-γ的水平。4. 统计分析HBV+DRibbles刺激乙肝患者PBMC产生IFN-y的水平与临床分期和疾病转归相关。结果：1.转染HBV全基因的人肝癌细胞株HepG2.2.15细胞和Huh7.6细胞释放自噬小体的检测与比较：1) Western Blot检测显示HepG2.2.15细胞DRibbles中LC3以LC3II为主；2)透射电镜检查发现HepG2.2.15细胞DRibbles为双层膜结构；3) DRibbles中可募集到HBV抗原成分HBsAg和HBeAg, HepG2.2.15细胞来源HBV+ DRibbles中HBV抗原含量明显高于Huh7.6细胞。2. HBV+DRibbles能有效刺激乙肝患者PBMC产生IFN-γ,并呈现剂量依赖性；HBV+DRibbles刺激乙肝患者PBMC产生IFN-γ水平显著高于HBV DRibbles,而且明显高于健康鲜血者PBMC。3. HBV+DRibbles刺激急性期乙肝治愈患者产生IFN-γ水平显著高于慢性乙肝患者,HBV+DRibbles刺激下患者IFN-γ的分泌量与乙肝患者的ALT和AST水平呈现有一定负相关性关联。结论：1.成功制备HepG2.2.15细胞的自噬小体(HBV+DRibbles), HBV+DRibbles中富含HBV抗原成分；2. HBV+DRibbles能特异性刺激乙肝患者PBMC产生IFN-γ,而且IFN-γ水平与临床分期和疾病转归存在一定关联。