研究背景目的髓母细胞瘤（medulloblastoma, MB）属神经上皮肿瘤,是小儿脑部最常见的恶性肿瘤之一。MB大约占小儿脑肿瘤的1/4,发病年龄高峰在5-10岁,男性多于女性,发病率在小儿仅次于星形胶质细胞瘤；在成人,80%的MB发病年龄在21-40岁。MB是来源于神经外胚层肿瘤之一,一般认为神经外胚层肿瘤具有向神经元及胶质细胞的双向分化的特征,2000年WHO将MB分型分为五种,分别是经典型、成结缔组织型、大细胞型、髓肌母细胞型和黑色素型。另外,MB还具有侵袭性生长的特性,有极强的浸润性和转移性,肿瘤细胞可沿脑脊液途径转移,可以向侧脑室及三脑室播散,也可以沿硬脊膜下腔播散,侵犯脊髓,造成神经根压迫症状或截瘫,其治愈率低、死亡率高,预后差。近年来,由于神经外科手术技巧及放疗技术的不断进步、化疗药物的应用以及治疗的不断规范化,MB的死亡率及致残率均明显下降,目前,MB 5年生存率在50%～70%,10年生存率在30%-50%。尽管近年来MB的治疗取得了很大的进步,但仍有相当一部分患者死于肿瘤的复发和侵袭、转移,因此与MB增殖、侵袭等相关机制的生物学研究成为近年来研究的热点。肿瘤的侵袭转移是一个非常复杂的多步骤的过程,需要突破细胞外基质和基膜组成的多个结构屏障：癌细胞从原发灶脱落,通过上皮基底膜,侵入周围基质和邻近组织,然后进入血管或淋巴管,逃避免疫监视,接着从脉管中渗出,在远隔部位建立新的增殖旺盛的细胞集落。这其中的每个事件都相当复杂,其整个过程受到由许多条信号通路相互交联组成的信号转导网络的精确调控。从肿瘤的侵袭转移过程可以看出,肿瘤细胞的粘附和迁移活性的交替变换对肿瘤的侵袭转移至关重要。Rho蛋白（包括Rho、Rac1、Cdc42）具有GTP酶活性,在肿瘤的发生发展中扮演重要角色,尤其是Rho蛋白及其下游的效应分子,通过多种信号转导通路,参与肿瘤的恶性转型、浸润转移及血管生成等多方面过程,它们已成为非常有希望肿瘤治疗的新靶点。Rac1（Ras相关的C3肉毒杆菌底物蛋白1）则是其重要成员之一,它位于人类7号染色体短臂2区2带（7p22）,分子量是25KD,Genebank NO:NM₀06908, Genebank概述Rac1基因编码的蛋白属于Ras超家族小GTP结合蛋白,它的作用是调节细胞的多种功能,包括控制细胞生长、细胞骨架的重组和蛋白激酶的激活。研究发现Rac1在细胞迁移、细胞与细胞及细胞与细胞外基质的黏附、细胞分裂和细胞失巢凋亡等方面也有重要作用。人类基因组中有三种Rac蛋白,即Rac1、2和3。这三种蛋白高度同源,但在转录调节和组织分布中却不同,Rac1广泛分布,Rac2在造血组织中表达,Rac3在脑组织中高表达,在其他组织中低表达。Rac1蛋白存在Rac1-GDP（失活状态）和Rac1-GTP（激活状态）两种形式,在细胞的信号转导通路中作为信号转换器或分子开关,作用于细胞骨架或其它的靶蛋白而产生生物效应。Rac1的上游调节分子是Tiaml,即T淋巴瘤侵袭转移诱导因子；其下游效应分子是PAK1,即P21激活激酶1。Racl的不同作用是通过调节不同的信号转导通路来实现。Salhia等用RNAi的方法沉默Rac1基因,观察Rac1基因沉默对星形细胞瘤细胞形态变化、运动能力及侵袭力的影响；Amanda等通过RNAi沉默Rac1基因,结果发现恶性胶质瘤细胞和乳腺癌细胞侵袭力明显减弱；Klooster等又进一步研究了Racl如何调节PAK1的分子机制,并发现Rac1的激活启动了细胞（HEK293细胞株）肌动蛋白的聚合、胞膜的突出和细胞移动。RNA干扰是通过实验手段向细胞内导入一段双链RNA （dsRNA）,宿主细胞对这段dsRNA迅即产生反应,其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA,即siRNA,这些siRNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效特异地阻断体内特定基因的表达,使细胞出现特定基因缺失的表型,从而达到某些实验或治疗目的。目前,国内外对于Rac1与MB的相关研究报道还很少,为了阐明其确切功能,我们以MB组织和细胞株为研究对象,以胶质瘤为参照、探讨Rac1基因在MB中的表达及其与肿瘤侵袭转移的关系。首先探讨Racl蛋白在不同级别胶质瘤、MB组织和正常脑组织中的表达,初步明确Racl蛋白与肿瘤发生、发展的可能关系；并在此基础上以Daoy细胞株为研究对象,构建RNAi重组载体,利用RNA干扰技术抑制Daoy细胞中Rac1基因的表达,观察Rac1基因沉默后肿瘤细胞的移动、侵袭、增殖、凋亡能力的变化并观察细胞骨架、细胞形态的变化。从多个角度对假设的功能进行进一步了解和验证。为全面研究MB中Rac1的生物学特性奠定基础,并为今后基因治疗MB提供理论依据。材料与方法1.Rac1在MB、胶质瘤组织中的表达及其临床意义用免疫组织化学S-P法、RT-PCR, Western blot方法检测Rac1在MB、胶质瘤组织中的表达,并分析Rac1表达与胶质瘤、MB临床病理特征的关系。2.Rac1对MB表型的影响为检测Rac1对MB Daoy细胞增殖、粘附、移动和侵袭等表型的影响,利用基因重组技术构建Rac1 shRNA真核表达载体（RNA interference, RNAi）,并以Daoy细胞作为模型,转染重组载体后观测对MB Daoy细胞株细胞表型的影响,并分析Rac1在MB发生、发展和转移中的作用及其可能机制。2.1. Rac1 shRNA重组载体的构建根据siRNA设计的原则,设计合成siRNA核苷酸序列,并设计一对非相关核苷酸序列作为对照,按常规操作处理后把shRNA序列克隆到pGPU6/Neo载体中,重组质粒酶切和测序鉴定。2.2.转染细胞和建立稳定转染细胞克隆采用脂质体进行细胞转染,细胞转染后用分别用800μg/ml G418筛选阳性细胞克隆,挑取单克隆细胞扩增培养。2.3.Racl表达调控效应检测逆转录聚合酶链式反应和免疫印迹检测Rac1mRNA和蛋白质水平表达改变。2.4.激光共聚焦显微镜观察Rac1对Daoy细胞形态、骨架的影响观察MB Daoy细胞株中Rac1基因沉默和Rac1基因表达增强后,Daoy细胞形态和细胞骨架的变化。2.5.平板克隆试验检测Rac1对Daoy细胞增殖的影响。2.6.单层细胞划痕愈伤实验单层细胞划痕愈伤实验分析Rac1对Daoy细胞移行的影响。2.7.侵袭实验观察Rac1基因表达对Daoy细胞侵袭能力的影响。2.8.细胞周期与凋亡试验探讨Rac1基因表达对Daoy细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。结果1.星形细胞肿瘤、MB及正常脑组织中Rac1蛋白的检测Rac1免疫组化阳性细胞为胞浆着色或胞浆、胞膜均着色。112例星形细胞肿瘤组织中均有不同程度Rac1的阳性表达,Rac1阳性指数（Rac1 LI, Rac1 Label index）为2.3%～63.0%,平均Rac1 LI为13.80%,正常脑组织少见Rac1阳性染色。Ⅰ～Ⅳ级星形细胞肿瘤相邻级别Rac1阳性率之间差异有显著性意义（P<0.01）。Rac1表达与星形细胞肿瘤的级别密切相关（r=0.484,P<0.01）,与年龄、性别无关。40例MB组织中Rac1均有不同程度的阳性表达,Rac1 LI为23.4%～87.5%,平均Rac1 LI为50.5%,正常脑组织少见Rac1阳性染色,二者阳性率之间差异有显著性意义（P<0.01）。31例胶质瘤组织中均有Rac1mRNA呈高表达（1.077±0.025）,25例MB组织中Rac1mRNA也呈高表达（1.067±0.104）：,8例正常大脑组织中不表达Rac1mRNA（0.025±0.005）；胶质瘤组织灰度值显著高于正常脑组织,（P=0.000）,差异具有统计学意义；MB组织与正常脑组织相比,（P=0.000）,差异也有统计学意义。31例胶质瘤组织中均有Rac1蛋白的高表达（1.25±0.10）,显著高于正常脑组织（0.013±0.006）,（P=0.000）,差异具有统计学意义；25例MB组织中Rac1蛋白呈高表达（1.200±0.100）,显著高于正常脑组织,（P=0.000）,差异也有统计学意义。2. Rac1RNAi重组载体的构建及鉴定2.1.成功构建Rac1shRNA真核表达载体,经酶切和测序证实插入序列与设计序列完全一致；2.2.重组质粒转染MB Daoy细胞株,经G418抗性筛选得到稳定细胞克隆株；2.3.转染后,RT-PCR和Western blot分别从mRNA、蛋白水平证实Rac1 shRNA抑制Daoy细胞内源性Rac1的活性；2.4.Rac1沉默后Daoy细胞骨架和细胞膜伪足的变化：Daoy细胞转染Rac1shRNA后,细胞交联的F-actin网的形成紊乱,且数量减少,细胞膜伪足形成也减少；而对照质粒组Daoy细胞F-actin网的形成正常,可以见到细胞膜伪足的形成；2.5.通过平板克隆实验,证实转染pGPU6/Neo/Rac1-352后对Daoy细胞的增殖具有明显抑制作用；2.6.单层细胞划痕24 h后,与对照组比较,Rac1/shRNA组和Rac1/N17组细胞迁移数明显减少；Rac1/L61组细胞迁移数增加,各组细胞迁移数分别是Rac1/shRNA组：90±10；Rac1/N17组：744±11;Rac1/L61组：2764±11；对照组：216±12。经统计学分析,Rac1/shRNA组与对照组（P<0.01）,Rac1/N17（93±5）与对照组（P<0.01）,Rac1/L61组与对照组（P<0.05）；Transwell侵袭试验中,各组细胞迁移数计数结果：Rac1/shRNA组：44±5, Rac1/N17组：35±5, Racl/L61组：90±5,对照组：76±7。经统计学分析,肿瘤细胞侵袭能力比较,Rac1/shRNA组与Racl/N17组比较,差异均无统计学意义（P>0.05）,Rac1/shRNA组与对照组比较, Racl/N17与对照组比较, Racl-L61组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。2.7. Rac1-shRNA质粒（Rac1-shRNA）转染Daoy细胞48小时后,经流式细胞仪检测结果显示,细胞周期受阻于Go-G1期,Go-G1期细胞所占比例明显增加,平均为80.93%,而S期所占细胞比例减少,平均为11.86%；空质粒对照组（Control）Go-G1期和S期所占细胞比例平均分别为58.80%和30.67%。Rac1基因沉默抑制Daoy细胞的细胞周期进程（P<0.05）。2.8. Daoy细胞转染后在不同时间点测定细胞凋亡的变化：结果Rac1-shRNA质粒组Daoy细胞凋亡率为36.767±3.950%,而空质粒对照组细胞凋亡率为8.567±0.987%,Racl基因沉默促进细胞凋亡（P<0.01）。结论Rac1基因在MB中存在着的过表达,过表达Racl基因可以促进MB Daoy细胞的增殖及克隆形成能力,增强其迁移、侵袭能力并抑制肿瘤细胞的凋亡,促进肿瘤的形成；靶向抑制Rac1基因可抑制MB Daoy细胞的增殖、降低其克隆形成能力、抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭并促进细胞凋亡。本研究证实Rac1基因与MB的侵袭、发生、发展密切相关,是与MB相关新的癌基因；Rac1在MB病程演进中发挥正向调控作用；深入研究MB中Rac1生物学行为为MB的防治提供了新的思路和干预靶点。