成瘾物质引起的中毒性脑病常见于阿片类药物、酒精等物质成瘾的人群,主要表现为成瘾(包括依赖、耐受和戒断行为)及中枢神经系统器质性损害。患者逐渐出现记忆力减退、反应迟钝等认知功能障碍表现,部分患者可出现严重的人格改变,或出现以错构或虚构为特征的感知觉障碍及头痛、脑血管意外等。随着我国经济的快速发展,罹患该类疾病的患者急剧增加,但医疗和社会的忽视与这种现象形成了尖锐的矛盾。吗啡是目前临床应用最为广泛的成瘾物质之一,研究报道,吗啡可以引起多个系统和器官的细胞坏死和凋亡。以往体内和体外研究发现,吗啡处理引起神经元凋亡。胶质细胞以往认为仅仅是大脑的支持细胞,最近研究发现在阿片类物质依赖性和耐受性的形成和维持当中发挥重要作用。其中小胶质细胞代表中枢神经系统固有的免疫防御体系,被认为中枢神经系统的主要免疫细胞。阿片样受体在阿片样物质效应中发挥关键作用,在小胶质细胞中已经鉴定存在全部三种阿片样受体,包括μμ、δ和κ受体。最近研究发现,吗啡处理可以引起小胶质细胞凋亡,纳洛酮(一种阿片受体阻滞剂)可以阻滞吗啡引起的小胶质细胞凋亡,但其具体分子机制仍然未知。丝氨酸/苏氨酸激酶Akt调节细胞活化,炎症反应和凋亡。激活的Akt可以调控细胞增殖和凋亡通路上的多种蛋白而发挥抗凋亡作用。激活的Akt磷酸化PI3K通路上的一些底物蛋白,如糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)等。GSK3β是可以被Akt在丝氨酸9位点磷酸化而灭活其蛋白活性的组成性活性酶。GSK3是细胞增殖和凋亡的重要调控点。大量证据表明,GSK3调控线粒体内源性凋亡途径和死亡受体介导的外源性凋亡途径的关键步骤。已经有研究报道Akt/GSK3β在吗啡诱导的神经元凋亡中发挥重要作用。但Akt/GSK3β在小胶质细胞中具体作用仍未知。P38 MAPK是MAPK家族中的重要组成部分,在细胞凋亡、炎症、应激反应和转录调节中发挥重要作用。最近研究发现吗啡处理可以引起脊髓背根神经节神经元中的磷酸化p38水平升高。而P38特异性抑制剂SB203580可显著降低吗啡止痛过程中的耐受性。P38 MAPK可以通过上调Bcl-2家族成员促凋亡蛋白Bax而促进细胞凋亡,但p38 MAPK在吗啡引起的小胶质细胞凋亡中的作用仍然未知。P-arrestins是一组多功能支架和接头蛋白,广泛表达分布于体内各种细胞,是G-protein-coupled receptors(GPCRs)信号途径的关键的负性调控分子和支架蛋白。最近研究证实P-arrestins介导抗凋亡信号通路,P-arrestins可通过调控Akt信号通路在生长因子受体介导的细胞增殖中发挥作用。但是,P-arrestins在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用仍然未知。为此,我们使用临床最常用的成瘾性物质,吗啡作用于体外原代培养小胶质细胞及BV-2小胶质细胞系,探讨了GSK3、p38 MAPK和β-arrestins信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用,以此深入研究成瘾物质引起中毒性脑病的发病机制。本研究分四个部分：第一部分吗啡激活并诱导小胶质细胞凋亡作用的研究目的使用体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系,观察吗啡处理后小胶质细胞激活和凋亡的相关变化,从而初步探讨吗啡对小胶质细胞的作用。方法1.体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系并进行吗啡处理体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞分别分组如下：1.正常对照组、吗啡组(2,5,10,20μM); 2正常对照组、吗啡组(6h,12h,24h);3.正常对照组、吗啡组(10μM)、纳洛酮组(10μM)、吗啡+纳洛酮组(纳洛酮提前吗啡1h加入使之预先与阿片类受体结合)。置细胞培养箱孵育。2.细胞存活率的检测使用MTT法检测细胞存活率。将细胞以1×104/孔的密度铺在96孔培养板内,使用不同浓度吗啡处理,然后将20μ1 MTT加入每个孔中,将培养板置于37℃孵育4小时。然后用ELISA读数仪在570nm波长下检测比色度。3.细胞凋亡的检测体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系以1×105/孔种植于铺有载玻片的12孔板中,置于细胞培养箱孵育,用吗啡及纳洛酮处理后,取出载玻片,将其用丙酮/甲醇(1：1)室温固定5分钟,然后按照TUNEL试剂盒指示进行操作检测细胞凋亡。4. Western Blotting使用Western Blot方法检测BV-2小胶质细胞经吗啡处理后cleaved caspase-3,caspase-3等蛋白水平的变化,用GAPDH作为实验内参。收集各组实验细胞后,使用RIPA Lysis Buffer裂解离心后用12%SDS-PAGE将样品蛋白电泳分离,然后转膜至硝酸纤维膜。将膜用5%脱脂奶粉室温封闭2小时,然后用一抗4℃孵育过夜后,再用二抗室温孵育1小时。最后暗室曝光并扫描记录结果。5.细胞免疫荧光染色使用细胞免疫荧光检测体外培养原代小胶质细胞经吗啡处理后cleaved caspase-3蛋白水平变化,用RCA-1作为小胶质细胞标志物。以1×105/孔种植于铺有载玻片的12孔板中,用吗啡及纳洛酮处理后,取出载玻片,将其用丙酮／甲醇(1：1)室温固定5分钟,将固定后的小胶质细胞用一抗室温孵育过夜,然后用二抗避光室温孵育2小时。最后用荧光倒置显微镜和Leica TCS SP2 Laser Scanning共聚焦显微镜观察实验结果。6. RT-PCR使用RT-PCR检测小胶质细胞经吗啡处理后CD11b、TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平变化,用beta-Actin作为实验内参。收集各组实验细胞后,抽提RNA。以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA。以cDNA为模板,用小鼠CD11b、TNFα、IL-1β和IL-6相应引物特异性扩增相应的基因。用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行半定量检测。结果1.吗啡通过阿片受体途径激活小胶质细胞吗啡(2,5,10,20μM)处理后小胶质细胞激活标志物CD11b mRNA水平呈剂量和时间依赖性升高,较未处理组有显著差异。阿片类受体阻断剂纳洛酮可以阻断吗啡的作用。2.吗啡通过阿片受体途径诱导小胶质细胞凋亡MTT结果显示吗啡(2,5,10,20μM)处理后小胶质细胞存活率呈剂量依赖性明显下降。TUNEL染色显示吗啡处理(10μM)使小胶质细胞凋亡明显增加,较未处理组有显著差异。Western Blot结果显示吗啡(10μM)处理使BV-2小胶质细胞中caspase-3活化明显升高,而体外培养原代小胶质细胞cleaved caspase-3和小胶质细胞标志物RCA-1双抗体免疫荧光染色也得到一致的结果。并且纳洛酮可阻断吗啡引起的小胶质细胞凋亡及caspase-3激活。3.吗啡通过阿片受体途径诱导小胶质细胞细胞因子表达RT-PCR的方法检测了小胶质细胞经吗啡(10μM)处理后TNFαIL-1β和IL-6 mRNA的表达,发现小胶质细胞中上述三种细胞因子表达明显增加,较未处理组有显著差异。纳洛酮可阻断吗啡的作用。结论1.吗啡通过阿片受体途径激活并诱导小胶质细胞细胞因子的表达。2.吗啡通过阿片受体途径诱导小胶质细胞凋亡,caspase-3途径介导了吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。第二部分GSK3β信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用研究目的使用体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系探讨GSK3β信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用及其具体机制。方法1.体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系并进行吗啡处理体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞分别分组如下：1.正常对照组、吗啡组(2,5,10,20 u M)；2.正常对照组、吗啡组(6h,12h,24h) 3.正常对照组、吗啡组(10μM)、纳洛酮组(10μM)、吗啡+纳洛酮组(纳洛酮提前吗啡1h加入使之预先与阿片类受体结合)；4.正常对照组、吗啡组、SB216763组(10μM)、吗啡+SB216763组(SB216763提前1h加入)。置细胞培养箱孵育。2. Western Blotting使用Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-Akt、phosphor-GSK3β、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、phosphor-p38、Bax、Bcl-2等蛋白水平变化。3.细胞凋亡的检测使用TUNEL染色法检测小胶质细胞凋亡。4. RT-PCR使用RT-PCR检测小胶质细胞Bax和Bcl-2 mRNA水平变化。结果1.吗啡通过阿片受体途径使小胶质细胞phosphor-Akt和phosphor-GSK3β蛋白水平降低Western Blot结果显示,吗啡使小胶质细胞phosphor-Akt和phosphor-GSK3p蛋白水平明显降低,且表现为时间和剂量依赖性,纳洛酮可阻断吗啡的作用。2.抑制GSK3β增加吗啡诱导的小胶质细胞凋亡TUNEL方法检测细胞凋亡,发现特异性GSK3β抑制剂SB216763预处理显著增加了吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。Western Blot方法检测小胶质细胞cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平,发现SB216763预处理可以明显增加吗啡引起的caspase-3和caspase-8活化。3.抑制GSK3β使吗啡处理引起的Bax/Bcl-2和phosphor-p38变化增加Western Blot方法检测小胶质细胞Bax和Bcl-2蛋白水平变化,发现吗啡处理使小胶质细胞Bax水平升高,Bcl-2水平降低。而SB216763预处理增加了吗啡引起的Bax/Bcl-2变化。RT-PCR方法检测小胶质细胞中Bax和Bcl-2 mRNA表达变化,发现吗啡处理使小胶质细胞Bax mRNA水平升高,Bcl-2 mRNA水平降低,而SB216763预处理增加了吗啡引起的Bax/Bcl-2 mRNA变化,与蛋白变化一致。Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-p38水平,发现吗啡处理使小胶质细胞phosphor-p38水平升高,纳洛酮可阻断吗啡的作用。而SB216763预处理可显著增加吗啡引起的phosphor-p38升高。结论1.吗啡通过阿片受体途径使小胶质细胞phosphor-Akt和phosphor-GSK3β蛋白水平降低。2.抑制GSK3β增加吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。3.抑制GSK3β增加吗啡引起的Bax/Bcl-2水平变化。4. GSK3β对Bax和Bcl-2的表达调控发生在转录水平。5.抑制GSK3β可增加吗啡处理引起的phosphor-p38水平升高。第三部分P38 MAPK信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用研究目的使用体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系探讨p38 MAPK信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用及其具体机制。方法1.体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系并进行吗啡处理体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞分别分组如下：1.正常对照组、吗啡组(10u M)、纳洛酮组(10μM)、吗啡+纳洛酮组(纳洛酮提前吗啡1h加入使之预先与阿片类受体结合)；2.正常对照组、吗啡组、SB203580组(10μM)、吗啡+SB203580组(SB203580提前1h加入)；置细胞培养箱孵育。2. Western Blotting使用Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-p38、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、Bax、Bcl-2等蛋白水平变化。3.细胞凋亡检测使用TUNEL染色法检测小胶质细胞凋亡。4. RT-PCR使用RT-PCR方法检测小胶质细胞Bax和Bcl-2 mRNA水平变化。结果1.吗啡处理使小胶质细胞phosphor-p38蛋白水平升高Western Blot结果显示,吗啡使小胶质细胞phosphor-p38水平升高,而纳洛酮可阻断吗啡的作用。2.抑制p38 MAPK减少吗啡诱导的小胶质细胞凋亡TUNEL方法检测细胞凋亡,发现p38 MAPK特异性阻滞剂SB203580预处理明显减少了吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。Western Blot方法检测小胶质细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平,发现SB203580预处理可以明显减少吗啡引起的caspase-3和caspase-8活化。3.抑制p38 MAPK减少吗啡处理引起的Bax/Bcl-2变化Western Blot方法检测小胶质细胞中Bax和Bcl-2蛋白水平变化,发现吗啡处理使小胶质细胞Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低。而SB203580预处理减少了吗啡引起的Bax/Bcl-2蛋白变化。RT-PCR方法检测小胶质细胞中Bax和Bcl-2 mRNA表达变化,发现吗啡处理使小胶质细胞Bax mRNA水平升高,Bcl-2 mRNA水平降低。而SB203580预处理减少了吗啡引起的Bax/Bcl-2 mRNA变化,与蛋白变化趋势一样。结论1.吗啡通过阿片受体途径增加小胶质细胞phosphor-p38水平。2.抑制p38减少吗啡诱导的小胶质细胞凋亡3.抑制p38减少吗啡处理引起的Bax/Bcl-2变化。4.P38对Bax和Bcl-2的调控发生在转录水平。第四部分β-arrestin 2信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用研究目的使用体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系探讨β-arrestin 2信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用及其机制。方法1.体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系并进行吗啡处理体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞分别分组如下：1.正常对照组、吗啡组(2,10μM)；2.正常对照组、吗啡组(10μM)、纳洛酮组(10μM)、吗啡+纳洛酮组(纳洛酮提前吗啡1h加入使之预先与阿片类受体结合)；置细胞培养箱孵育。2.基因转染将携带P-arrestin 2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞实验各组细胞。转染48h后,将培养基更换为不含血清的DMEM培养基,并进行后续实验。3.细胞存活率的检测使用MTT方法检测小胶质细胞存活率。4.细胞凋亡检测使用TUNEL染色法检测小胶质细胞凋亡。5. Western Blotting使用Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-Akt和cleaved caspase-3等蛋白水平变化。结果1.吗啡处理引起小胶质细胞P-arrestin 2蛋白水平降低Western Blot结果显示,吗啡使小胶质细胞β-arrestin 2蛋白水平明显降低,而P-arrestin 1蛋白水平无明显变化。纳洛酮可阻断吗啡的作用。2.高表达β-arrestin 2可减少吗啡引起的小胶质细胞凋亡将携带P-arrestin 2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞,然后进行吗啡处理。MTT检测细胞存活率,发现高表达P-arrestin 2可减少吗啡处理引起的细胞存活率下降。而RNA干扰减少β-arrestin 2水平,可增加吗啡处理引起的细胞存活率下降。采用TUNEL方法检测细胞凋亡,发现高表达β-arrestin 2,可减少吗啡处理引起的细胞凋亡。而RNA干扰减少P-arrestin 2水平,可增加吗啡处理引起的细胞凋亡。Western Blot结果显示高表达β-arrestin2,可减少吗啡处理引起的caspase-3激活,而RNA干扰减少β-arrestin 2水平,可增加吗啡处理引起的caspase-3激活。3.β-arrestin 2通过激活Akt发挥对小胶质细胞的保护作用将携带β-arrestin2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞,然后进行吗啡处理。Western Blot结果显示,高表达P-arrestin 2可缓解吗啡引起的phosphor-Akt水平降低,而通过RNA干扰降低P-arrestin 2水平,可增加吗啡引起的phosphor-Akt降低。结论1.吗啡通过阿片受体途径引起小胶质细胞β-arrestin 2蛋白水平降低。2.高表达β-arrestin 2可减少吗啡处理引起的小胶质细胞凋亡。3.高表达β-arrestin 2通过激活Akt发挥对小胶质细胞的保护作用。