论文部分内容阅读
[目的]基于MiSeq二代测序平台构建一个高通量Y-STR遗传标记复合检测体系,进行江苏汉族人群的Y-STR遗传多态性研究,获得各Y-STR基因座的序列多态性、相关群体遗传和法医学参数,为法医学应用提供理论依据和基础数据。[方法]1.通过商业化试剂盒及文献调研筛选75个法医常用Y-STR基因座和1个性别判定Amelogenin基因座作为候选。使用Primer 5.0软件设计76个基因座的特异性引物,以2800M标准品(Promega公司)作为DNA样本,引物合成后通过PCR、琼脂糖凝胶电泳实验验证引物有效性。2.通过MiSeq FGx平台,使用PCR-Free法进行文库构建,构建完成的文库进行定量和质检。经引物序列及引物浓度调整优化复合扩增体系,构建复合扩增体系。3.收集149例江苏汉族无关个体FTA 口腔试纸样本,2800M作为阳性对照,超纯水作为阴性对照。使用PrepFiler Automated Forensic DNA Extraction试剂盒提取样本DNA,使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit对样本DNA进行定量。利用建立的复合分型体系进行分型。4.通过Notepad软件中录入基因座的配置文件并利用STRait Razor 3.0软件对MiSeq FGx平台生成的fastq文件进行分析,获取各基因座的等位基因分型及序列信息。5.使用Arlequin Version 3.5软件计算各基因座的法医学应用参数。采用直接计算法计算人群样本的基因多样性(Gene Diversity,GD)和单倍型多样性(Haplotype Diversity,HD)。在分析样本数据各基因座的序列时,使用Cluster X软件进行多序列的比对。并使用Origin Pro 9.0作图软件对数据进行作图分析。[结果]1.本研究成功构建由67个Y-STR基因座和1个性别判定Amelogenin基因座组成的复合扩增体系,该体系扩增片段长度范围在350bp以下,1.0ng模板DNA可获得满意的分型结果。在江苏汉族群体中,149例无关男性个体全部成功分型,共检出149种单倍型,总体单倍型多样性(HD)和Y-STR分型系统的分辨能力(DC)分别为0.999999......和0.999999......。基因多样性(gene diversity,GD)值为 0.1275-0.9969,53 个 Y-STR基因座的 GD 值大于 0.6。67个Y-STR基因座共检出814个等位基因,包含了重复区的序列多态性及侧翼区的序列多态性。相比基于长度多态性分型,等位基因增加349个。2.在江苏汉族149例男性无关个体中,3个Y-STR基因座出现等位基因异常分型的情况,其中有5例样本在DYF387a/b表现为三等位基因模式。1例样本在DYS404Sla/b基因座表现为三等位基因模式;6例样本在DYF399Sla/b/c基因座表现为四等位基因模式,1例样本在DYF399Sla/b/c基因座表现为五等位基因模式。3.本研究对67个Y-STR基因座的序列多态性进行了研究,有45个Y-STR基因座存在长度相同但序列不同的情况,其中DYS385a/b、DYS388、DYS389 Ⅰ、DYS390、DYS439、DYS459a/b、DYS481、DYS522、DYS531、DYS576、DYS626 基因座在侧翼序列存在差异碱基。与以往研究进行比对,在 50 个 Y-STR(DYS19、DYS385a/b、DYF387Sla/b、DYS389 Ⅱ、DYS391、DYF399SIa/b/c、DYS404Sla/b、DYS439、DYS443、DYS444、DYS446、DYS447、DYS448、DYS449、DYS458、DYS459a/b、DYS460、DYS485、DYS505、DYS508、DYS510、DYS518、DYS520、DYS527a/b、DYS531、DYS552、DYS557、DYS587、DYS593、DYS596、DYS612、DYS617、DYS622、DYS626、DYS627、DYS630、DYS641、DYS644、DYS645、DYS710、DYS720、Y-GATA-A10、Y-GATA-H4)基因座上发现369个新重复区变异;在11个 Y-STR(DYS385、DYF387S1、DYS388、DYS389 Ⅰ、DYS390、DYS439、DYS459、DYS481、DYS522、DYS531、DYS626)基因座发现13个新侧翼变异。4.本研究对核心重复结构为复合重复结构的27个Y-STR基因座进行了 stutter序列分析,有 10 个 Y-STR(DYS390、DYS437、DYS447、DYS448、DYS520、DYS552、DYS587、DYS593、DYS596、DYS622)基因座的stutter序列的测序深度占靶基因的比例小于10%;有15个Y-STR(DYS19、DYF387a/b、DYS389Ⅱ、DYS449、DYS510、DYS518、DYS527a/b、DYS557、DYS626、DYS627、DYS630、DYS635、DYS710、DYS720)基因座的 stutter序列的测序深度占靶基因的比例大于10%,而小于20%;DYS612基因座的stutter序列测序深度偏高,测序深度占靶基因的0.4188±0.0688。DYS710基因座在样本中出现了 2bp复制滑脱的非特异性扩增,测序深度占靶基因的0.3372±0.087。DYS19基因座在样本中出现了 2bp复制滑脱的非特异性扩增,测序深度占靶基因比例小于10%。[结论]1.本研究使用NGS技术,构建了 67个Y-STR基因座和1个性别判定Amelogenin基因座的复合扩增体系,检出通量大,分型稳定、准确,可应用于法医学实践。2.该体系在江苏汉族群体中具有高度遗传多态性,获得的法医学参数和群体遗传学数据可以为法医学实践和人类遗传学研究提供基础数据。3.45个Y-STR基因座存在长度相同但序列不同的情况,其中有13个Y-STR基因在侧翼序列上存在差异碱基。在50个Y-STR基因座发现369个新等位基因,在11个Y-STR基因座发现13个新侧翼序列变异。侧翼序列的差异碱基可以提高个体识别力和法医学鉴定效能,对Y-STR基因座的个体识别起到辅助作用。新等位基因为Y-STR基因座提供了更丰富的遗传多态性,同时也为群体遗传学研究提供基础数据。4.发现DYF387a/b、DYS404S1a/b、DYF399S1a/b/c基因座在江苏汉族群体中出现基因异常分型的情况。Y-STR基因座的异常分型可提高个体识别力,但在混合斑鉴定中需特别注意这种异常分型情况的发生。