栉孔扇贝（Chlamys farreri）是我国北方沿海重要的养殖经济贝类之一，但自1997年起连续暴发的“大规模死亡症”导致了该产业的巨大损失。近年的研究证实，急性病毒性坏死病毒（Acute virus necrosis virus, AVNV）是其主要的致病病原。该病毒为双链DNA病毒，病毒颗粒为具囊膜的二十面体结构，直径大小为130～170nm。2009年,任伟成等完成了AVNV病毒的全基因组测序分析，预测AVNV基因组中含有123个潜在的开放阅读框（open reading frames，ORF），其中44个ORF具有一定的结构和功能，推测可能与病毒DNA复制、核酸代谢、修饰以及病毒与宿主相互作用等有关。而ORF074推测为编码脱氧尿苷焦磷酸酶（dUTP pyrophosphatase, dUTPase）的基因，主要与病毒DNA复制有关（任伟成等，2009）。脱氧尿苷焦磷酸酶（dUTP pyrophosphatase, dUTPase）是一种生物界普遍存在的重要水解酶，它与DNA复制和病毒毒力密切相关。为确定ORF074是否编码特定的具有功能的酶或蛋白，以及编码蛋白在AVNV感染、复制及AVND暴发中的作用，作者根据栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒ORF074基因序列，构建了dUTPase基因的原核表达载体，在E.coli中进行原核表达、纯化并对重组dUTPase的酶学活性进行了分析；构建了dUTPase基因的真核表达载体pEGFP-N1-dut并在草鱼肾脏细胞（CIK）中进行了真核表达及亚细胞定位分析。此外，对AVNV病毒感染栉孔扇贝不同时间的基因表达进行荧光定量PCR分析，在mRNA水平进行转录和表达时序分析，探讨了基因对病毒在宿主体内复制的影响。另外，为构建AVNV的体外扩增系统，为更深入研究其侵染机制和致病机理提供技术平台，取健康栉孔扇贝的外套膜、血淋巴、鳃、闭壳肌、肾脏等组织进行体外的原代和传代培养，初步研究并建立了栉孔扇贝组织细胞的体外培养技术，为之后的研究提供了有益的探索。1.AVNV dUTPase基因的克隆及原核重组表达。根据AVNV基因组序列，设计特异性引物，扩增编码AVNV dUTPase的ORF074,经1%琼脂糖凝胶电泳得到一条约750bp大小的条带，双酶切后将其连接至pET32a中构建重组原核表达载体pET32a-dut，并将其转化至感受态细胞BL21（DE3）中，加IPTG至终浓度1mmol/L,诱导4-5小时后，SDS-PAGE电泳,得到一条约45kD的条带，经Western-blot及质谱分析确定为重组dUTPase。2.重组dUTPase的纯化及酶学活性分析。利用Co²⁺亲和层析柱对表达的重组dUTPase进行了纯化并测定了纯化的重组dUTPase的比活、底物特异性、不同金属离子及EDTA对其活性的影响等。结果显示：1、重组dUTPase具有较强的底物特异性，能特异的催化dUTP水解。2、Mg²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Zn²⁺等金属离子能增强重组dUTPase的催化活性，其中Mg²⁺作用效果最显著，依次为Mg²⁺> Ca²⁺>Co²⁺> Zn²⁺。3、EDTA能抑制重组dUTPase的活性，而Mg²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Zn²⁺等金属离子能在一定程度上解除这种抑制作用。3.利用荧光定量PCR技术完成了AVNV病毒感染栉孔扇贝后，dUTPase基因的转录时序分析。分别取感染AVNV病毒0,4,8,12,16,24,36,48h后栉孔扇贝的肝胰腺，提取总RNA，反转录，荧光定量PCR，确定了dUTPase基因在不同时间的表达。结果表明：该基因是一种早期基因，在AVNV感染栉孔扇贝4h后即开始表达，16h后达到峰值，之后逐步下降。4.利用RACE技术确定了dUTPase基因的转录起始位点。利用5’RACE技术确定了dUTPase基因的转录起始位点。首先用AVNV病毒感染栉孔扇贝，16h后提取肝胰腺的总RNA，随机引物反转录，用末端转移酶加poly（C）尾巴，之后用根据dUTPase基因设计的GSP引物及Adaptor（dG）进行PCR扩增，得到一条约250bp的条带，经测序发现其转录起始位点为起始密码子上游第十个核苷酸——胸腺嘧啶脱氧核苷酸。5.构建了重组真核表达载体pEGFP-N1-dut，并将其转染进草鱼肾脏细胞（CIK）中进行了真核表达及亚细胞定位分析。根据dUTPase基因的序列，设计真核表达用的特异性引物，双酶切后将其连接至真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组真核表达载体pEGFP-N1-dut，将重组载体转染至草鱼肾脏细胞（CIK）中，48h后，激光共聚焦显微镜观察其在CIK中的表达。表明重组质粒在CIK细胞的细胞质和细胞核中均有表达。6.培养得到了栉孔扇贝鳃、肾脏、闭壳肌、外套膜、血淋巴等5种组织的细胞，并进行了传代。取1龄、2龄栉孔扇贝的血淋巴、鳃、肾脏、闭壳肌、外套膜等5种组织进行组织培养，并将培养的以上5种组织进行传代，血淋巴细胞第二代即死亡，其他四种组织前2代生长良好，但至第三代死亡。综合本实验结果，可以得出以下结论:AVNV ORF074编码具有活性的dUTPase，该基因的转录起始位点为胸腺嘧啶脱氧核苷酸，该酶在草鱼肾脏细胞（CIK）的细胞质和细胞核中都有表达。同时该基因可能是一种早期基因，在AVNV感染栉孔扇贝4h后即开始表达，16h后达到峰值。另外，作者初步探索和建立了扇贝组织培养技术，为建立AVNV的体外增殖体系积累了一定的经验教训。