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目的: 近视的发生发展受到视觉输入的调控.视网膜上广泛存在的缝隙连接是视网膜进行横向和纵向信号传递的组成部分,参与了视网膜对外界视觉信号的处理和呈递,因而可能参与调控近视.本课题拟明确视网膜缝隙连接在豚鼠正常屈光发育以及形觉剥夺性近视中的作用,并分析近视形成过程中视网膜缝隙连接功能和缝隙连接蛋白的改变. 方法: 筛选屈光度在+3~+8 Diopter(D),双眼参差＜2D的3周龄三色豚鼠120只,雌雄不限,随机分为正常视觉环境组(Normal vision,NV)和形觉剥夺(Form deprivation,FD,右眼单眼剥夺)组.NV组又随机分为溶剂对照组(二甲基亚砜, DMSO;NV+V,n=20),低浓度18-β-甘草次酸(18-β-GA)组(NV+40μg,n=24),高浓度18-β-GA组(NV+120μg,n=22).FD组又随机分成FD+溶剂对照组(FD+V, n=18) , FD+低浓度 18-β-GA 组(FD+40μg , n=18) , FD+高浓度 18-β-GA 组(FD+120μg,n=18).溶剂注射组和18-β-GA给药组每天球旁注射DMSO或者相应剂量18-β-GA 100μl.实验前、实验后2周和4周分别检测屈光度和眼轴相关参数.实验结束后,采用Cut-loading检测视网膜水平细胞层Cx57缝隙连接的功能变化,同时采用蛋白印迹(Western blot, WB)检测Cx57的含量变化,免疫荧光(Immunofluorescence, IF)检测缝隙连接蛋白Cx36及其磷酸化的变化情况. 结果: 1.正常视觉环境下,给予豚鼠球旁注射18-β-GA 2周或4周,可诱导出近视,同时伴有眼轴的延长,且随着浓度的增加,引起的近视量加大.给药2周,NV+V组、NV+40μg组和NV+120μg组双眼屈光差值分别为 -0.51±0.16D、-2.19±0.31D和-4.11±0.45D;三组双眼眼轴差值依次分别为 0.01±0.01mm、 0.05±0.01mm 和0.07±0.01mm.给药4周,NV+V组、NV+40μg组和NV+120μg组双眼屈光差值分别为-0.55±0.16D、-2.86±0.46D、-5.46±0.57D,三组双眼眼轴差值依次分别为0.01±0.01mm 、0.05±0.01mm 、0.05±0.01mm.注射18-β-GA对前房深度和晶体厚度无明显影响,但在2周时可使玻腔深度明显延长. 2.球旁注射18-β-GA 2周,对形觉剥夺性近视(FDM)无明显作用;注射4周时,高浓度18-β-GA 促进FDM,但对眼轴长度无明显影响.给药 2 周,FD+V组、FD+40μg组和FD+120μg组双眼屈光差值分别为-5.15±0.41D、-6.44±0.57D、-6.11±0.65D ,三组双眼眼轴差值依次分别为 0.12±0.01mm、0.18±0.02mm、0.15±0.01mm.给药 4 周,屈光差值分别为-8.94±0.49D、-10.71±0.56D、-11.25±0.62D,三组的眼轴差值分别为0.24±0.02mm、0.27±0.02mm、0.26±0.02mm. 3. 采用Cut-loading技术对不同组别的视网膜进行切割,观察不同组别的示踪剂扩散情况.根据扩散公式,做出拟合图像,得到空间常数λ值,λ值越大则表明扩散速度越快,缝隙连接的开放程度越大.给予正常视觉环境下的豚鼠注射高浓度18-β-GA 2天,NV组与NV+V组相比,λ值无明显变化,表明注射溶剂对水平细胞层 Cx57 缝隙连接的开放程度无明显作用.NV+18-β-GA(120μg)组与NV+V 相比,λ 值无明显变化,在正常视觉环境下注射 18-β-GA 对水平细胞层Cx57 缝隙连接的开放程度无明显影响.给予豚鼠形觉剥夺 2 天后,FD 组相比NV组,λ值明显增大,即水平细胞层Cx57缝隙连接的开放程度增大. 4.注射18-β-GA 4周后,提取视网膜蛋白,进行WB实验.结果发现,无论是注射高浓度的18-β-GA,还是低浓度的18-β-GA,均对视网膜上Cx57的表达量无明显影响. 5.注射18-β-GA 4周,取冰冻切片后,进行免疫荧光染色.缝隙连接蛋白Cx36常常聚集在一起,形成Cx36斑块,因此分析时以这些斑块为基础.从以下几个角度进行描述,包括:p-Cx36与Cx36的相关分析、总Cx36的荧光强度、每个斑块的磷酸化水平(p-Cx36荧光强度/Cx36荧光强度)、Cx36阳性斑块中发生磷酸化的百分比(p-Cx36阳性斑块数/Cx36阳性斑块数×100%),以及每个斑块的平均面积.相关分析的结果显示,在内丛状层(IPL),各组的 p-Cx36 与 Cx36呈明显的线性相关关系.NV 组、NV+V 组、NV+18-β-GA(120μg)组的 R2分别为0.73、0.75、0.54.注射18-β-GA可使内丛状层Cx36斑块的荧光强度、Cx36斑块的磷酸化水平、Cx36斑块磷酸化的百分比均下降,而不改变Cx36斑块的平均面积.在外丛状层(OPL),各组的p-Cx36与Cx36也呈明显的线性相关关系, NV组、NV+V组、NV+18-β-GA组的R2分别为0.61、0.84、0.66.注射18-β-GA可使外丛状层 Cx36斑块的荧光强度和Cx36的平均面积均减少,而对Cx36斑块的磷酸化水平和Cx36斑块的磷酸化百分比无明显影响.形觉剥夺后,内丛状层Cx36斑块的荧光强度和面积均未发生显著改变,但其磷酸化水平以及发生磷酸化的百分比降低;而外从状层的Cx36斑块的荧光强度、面积以及磷酸化均未发生显著变化. 结论: 1.球旁注射缝隙连接拮抗剂18-β-GA可促进轴性近视的发生,同时伴有OPL和IPL的Cx36含量和磷酸化的降低.暗示缝隙连接可能通过调控视杆通路介导近视发生. 2.FD可增强水平细胞之间的电耦连,降低IPL的Cx36的磷酸化水平,说明水平细胞之间的电耦连和Cx36可能参与近视调控.