第一部分：　　 近十年来，G-杆菌耐药问题日益严重，突出表现在耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌（大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌等）、非发酵糖细菌（鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等），其中肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌耐药最为严重，临床治疗困难。产NDM-1超级细菌首先在印度新德里发现，主要见于大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌等肠杆菌科细菌，对临床常用的大多数抗生素包括碳青霉烯类抗生素耐药，可广泛传播，已经引起全世界的广泛关注和高度重视。　　 产NDM-1超级细菌对临床大多数抗生素耐药，治疗困难，而且其临床表现与敏感菌没有明显差异，临床诊断困难，临床上对碳青霉烯治疗无效的阴性菌感染需要考虑这类细菌感染可能。目前产NDM-1超级细菌的实验室检查主要分三步，该方法存在周期长、操作复杂、准确性不高等缺点。因此，迫切需要建立产NDM-1超级细菌的早期、快速、准确的诊断方法。　　 本论文旨在应用高灵敏度、高分辨率、高精确度的蛋白质谱检测技术(NanoUPLC Orbitrap)和生物信息分析系统，在现有耐药菌诊断技术和方法基础上，建立产NDM-1超级细菌感染的早期、快速、准确的诊断方法，研究不同抗生素对超级细菌耐药酶NDM-1的稳定性，将为临床超级细菌的诊断和治疗提供重要依据和技术支撑。　　 首先，应用基因工程技术获得NDM-1、OXA-23、VIM-2等7个重组细菌耐药酶，建立并优化了其蛋白酶解条件以及LC-MS/MS分析的液相条件和质谱条件，对7种重组耐药酶进行了分析，并应用Mascot软件将分析结果进行数据库搜索，结果满意，其中NDM-1的匹配度达到90％以上。　　 其次，应用LC-MS/MS技术检测细菌培养后复杂样品中的目的蛋白。以产NDM-1肺炎克雷伯杆菌为研究对象，通过细菌培养、超声裂解等方法获得含NDM-1的混合液样品，用LC-MS/MS检测，共鉴定出500多种蛋白包括NDM-1。　　 为模拟临床样本的检测，进一步确证所建方法的实用性，建立了产NDM-1肺炎克雷伯杆菌小鼠全身感染模型，并对感染前和感染后1h、2h、4h、8h小鼠血清中NDM-1进行了检测。结果显示，感染前及感染后小鼠血清中均检测到种类丰富的蛋白，小鼠感染后不同时间血清均检测到NDM-1，而感染前血清没有检测到NDM-1。采用实验室三步法对蛋白质谱检测结果进行验证，表明结果准确、可靠。　　 最后，应用LC-MS/MS和酶标仪，研究了NDM-1对5种β-内酰胺类抗生素的降解特性。结果表明，美罗培南对NDM-1的稳定性最低，10 min的相对水解率为100％，酶动力学参数Km为79.39±6.34 s-1。厄他培南和新药艾帕培南的稳定性次之，相对水解率在50％以上，Km值分别为120.11±10.53 s-1、113.81±11.59 s-1;新药百纳培南的稳定性较高，相对水解率为13％，Km值为240.26±38.56 s-1。NDM-1对氨曲南没有水解作用。酶动力学研究结果与稳定性实验结果一致。　　 综上所述，本研究在现有耐药菌诊断技术和方法基础上，探索性建立应用Nano UPLC Orbitrap液质联用技术检测细菌耐药酶的方法，并应用该技术对产NDM-1肺炎克雷伯杆菌的培养粗提物和动物感染血液中的NDM-1成功进行了检测。特别需要指出的是，在动物超级细菌感染早期不同时间血液中均检测到NDM-1，为临床超级细菌感染的早期、快速、准确诊断提供了重要依据和技术支撑。此外，研究了NDM-1对5种β-内酰胺类抗生素的降解特性，为指导临床合理用药提供了科学依据，对抗超级细菌药物的研发也具有重要的指导意义。　　 第二部分：　　 结核病(Tuberculosis，TB)是严重危害人类健康的呼吸道传染病，被列入我国法定重大传染病。我国是全球22个结核病高负担国家之一，世界卫生组织估计，目前我国结核病年发病人数位居全球第二位。同时，我国也是全球27个耐多药高负担国家之一。从20世纪80年代以来，随着耐药结核病（尤其是耐多药结核病）发病率的不断上升以及结核病与HIV/AIDS并发导致的结核病疫情再度上升，成为全球重大公共卫生问题和社会问题。然而，近40余年来几乎没有新作用机制的抗TB药物问世。　　 4-氧代-4-（4-甲氧基苯基）-2(E)-丁烯酸甲酯(YH-8)是我所研发的新一类抗结核化合物，具有较高的抗结核尤其是抗多药耐药结核的活性，安全性较好，具有良好的研发前景。本论文旨在研究YH-8在大鼠体内的吸收、分布，预测YH-8发生代谢性药物相互作用的潜在可能性，为该药物的进一步开发和应用奠定理论基础。　　 首先，我们建立了生物样本中YH-8的LC-MS/MS分析方法，并对方法学进行了验证，为之后的研究打下基础。　　 进一步，我们通过建立的定量分析方法，研究了YH-8在大鼠体内的血浆药代动力学参数。用非房室模型对其进行分析，得到高、中、低三个剂量的YH-8在大鼠内体的半衰期分别为7.16±0.62、7.13±0.65、7.21±0.57 h，三个剂量间的半衰期没有显著差异。三个剂量的药时曲线下面积(AUC0-t)分别为473.70±200.63、1145.40±466.62、2101.66±270.92 ng·h/mL。YH-8在大鼠体内呈线性动力学过程，给药剂量与药时曲线下面积呈正相关。　　 在组织分布实验中，单次灌胃给予大鼠YH-8后，采用LC-MS/MS方法测定各组织中原型药物的含量，结果显示，在小肠中YH-8含量最高，而在心脏、脾中的含量低于其他被检测的组织。YH-8在主要脏器的药物分布顺序为:肠＞肝＞肺＞肾＞心＞脾。在肺组织间液及肺巨噬细胞中YH-8也具有相当的含量。　　 为考察YH-8是否为受害药(Victim drug)，被单一的CYP450酶代谢，我们开展了YH-8的生物转化研究。YH-8与人肝脏S9组分和人肝微粒体共同孵育不同时间后，原药浓度逐渐降低，证明YH-8在人肝脏中可被代谢。接下来，我们选取了最常见的10种重组表达的人源CYP450酶，分别与YH-8共同孵育，考察参与YH-8代谢的CYP450酶种类。结果显示，上述10种CYP450酶均能不同程度的对YH-8进行代谢，即YH-8可以被多种CYP450酶代谢，因此YH-8不是受害药，与CYP450酶抑制剂联用时，代谢不会受到干扰。　　 在此基础上，借助质谱的不同扫描模式，我们对YH-8的代谢产物进行了初步的探索和预测，寻找到了3种代谢产物M1-M3。同时，在动物实验中，也证实了大鼠血浆和肝脏中这3种代谢产物的存在。　　 随后，我们考察了YH-8对主要CYP450酶的抑制作用，评价其是否为凶手药(Perpetrator drug)，干扰其他药物的代谢。结果显示，YH-8对主要CYP450酶的半数抑制率(IC50)除CYP1A2外均大于50μM，比对YH-8在大鼠体内的血药浓度，我们认为YH-8对主要CYP450酶无强烈的抑制作用。　　 综上所述，我们对YH-8的药代动力学参数及组织分布进行了研究，并使用体外代谢方法预测了YH-8与其他药物联用后发生代谢性药物相互作用的潜在可能性。结果表明，YH-8半衰期合理，适合一日三次的给药方式。YH-8组织分布较广，尤其靶组织中药物原型含量较高，但各组织中药物消除均较快，没有蓄积产生。此外，YH-8被多种CYP450酶所代谢，不是受害药，与P450酶抑制剂联用时，代谢不会受到干扰;YH-8对主要CYP450酶无强烈抑制作用，不是凶手药，不会干扰其他药物的代谢。