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研究背景和目的乳腺癌是常发于女性身上的恶性肿瘤,全世界每年约有50万患者死于乳腺癌,而治愈的难点是癌细胞的转移。大量研究表明,肿瘤细胞大量增殖后会从原发灶脱落,随着淋巴结或血管壁移动到其他组织,并且肿瘤细胞自身会分泌血管内皮生长因子促进血管的形成方便其扩散迁移,其中,骨是乳腺癌常见的转移位置。近年来研究发现乳腺癌细胞高表达基质细胞衍生因子-1特异性受体(CXCR4),且高转移性的乳腺癌细胞系CXCR4的表达率高于低转移性的乳腺癌细胞系。CXCR4作为基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的特异性配体在促进造血干细胞迁移方面的功能已经证实,也有众多研究表明SDF-1/CXCR4信号轴能激活细胞内信号通路及下游效应物从而调节细胞的增殖,趋化,转移等生理功能。因此,本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠乳腺癌4T1细胞中的CXCR4基因,建立一个稳定敲除CXCR4基因的4T1细胞株;并研究SDF-1/CXCR4信号轴在乳腺癌细胞增殖迁移方面的作用;同时探索SDF-1/CXCR4轴与整合素αvβ3通路之间是否存在相互作用。研究方法(1)根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计两条sgRNA,用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,挑取单克隆测序验证并扩大培养提质粒。(2)将重组好的质粒转染至293T细胞中包装成慢病毒。收集病毒并感染4T1细胞,通过嘌呤霉素筛选并用有限稀释法分离培养出单克隆细胞。并用RT-qPCR检测细胞株CXCR4基因mRNA表达情况;用蛋白免疫印迹法检测CXCR4蛋白质的表达情况。(3)用CCK-8检测敲除基因后4T1细胞(4T1-C)的增殖活性,通过划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力以及检测敲除基因后SDF-1对细胞迁移的趋化作用的影响。(4)用100ng/mlSDF-1处理正常4T1细胞(4T1-F)和基因敲除后的4T1细胞(4T1-C)后细胞12h后用蛋白免疫印迹法检测细胞中Akt,Erk,NF-κB的表达改变情况。(5)用不同浓度的SDF-1处理正常4T1细胞4h,8h,12h,24h和用不同浓度的SDF-1处理MAD-MB-231细胞24h,检测细胞中整合素αv亚基和β3亚基蛋白表达的变化。结果(1)成功构建了 LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒。(2)成功包装慢病毒,利用病毒感染4T1细胞后成功用嘌呤霉素筛选出单克隆细胞,并成功获得一株CXCR4基因缺失27个碱基的细胞株(4T1-C)。(3)用CCK-8检测细胞增殖活力结果显示,4T1-C在生长24h后,细胞增殖速率开始受到明显抑制(P<0.05),其抑制效果与加入了 AMD3100处理的细胞抑制效果相似。(4)划痕实验中,敲除了 CXCR4基因的细胞(4T1-C)与正常组细胞相比较,细胞迁移速率明显降低。通过transwell实验得出,SDF-1对细胞迁移有明显的趋化作用(P<0.05),但是当细胞敲除CXCR4基因后,SDF-1对细胞的趋化效果没有明显的统计学意义。对最终所有实验结果进行析因分析后,结果显示,在不同浓度SDF-1作用下,SDF-1能趋化4T1-F和4T1-L(空病毒载体感染后的4T1细胞)细胞迁移,但是不能有效的趋化4T1-C细胞迁移;同时4T1-F和4T1-L细胞之间细胞迁移数目没有统计学差异,4T1-C和4T1-F与4T1-L之间具有明显差异;在200ng/ml的浓度范围内,SDF-1浓度越高对4T1-F和4T1-L细胞迁移的趋化作用越明显。(5)WB结果显示,SDF-1处理4T1-F和4T1-C后,细胞中Akt总蛋白表达没有明显变化(P>0.05),4T1-F细胞Erk与NF-κB总蛋白的表达增加(P<0.05);4T1-C细胞Erk总蛋白表达不变,NF-κB总蛋白表达降低(P<0.05)。4T1-F细胞 p-Akt,p-Erk,p-NF-KB 表达均升高(P<0.05)。4T1-C 细胞 p-Akt,p-Erk,p-NF-κB表达不变。不同浓度SDF-1处理4T1-F细胞和MAD-MB-231细胞后,细胞内整合素αvβ3表达量没有明显改变。结论(1)利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞CXCR4基因并成功获得稳定细胞株。(2)敲除了 CXCR4基因的细胞增殖迁移能力相较于正常细胞明显降低。(3)SDF-1 与 CXCR4 结合后能引起下游 PI3K-AKT,MAPK/ERK,NF-κB信号通路的激活;而敲除CXCR4基因的细胞,不能有效激活引起下游PI3K-AKT,MAPK/ERK,NF-κB 信号通路。(4)在乳腺癌骨转移中,SDF-1/CXCR4通路与整合素αvβ3通路之间没有明显的相关性。