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大熊猫是我国特有的国家Ⅰ级重点保护的濒危物种,栖息地的严重片断化已致其现今仅分布于秦岭、岷山、邛崃、大相岭、小相岭和凉山等6个彼此完全隔离的山系。后更新世的气候突变虽导致众多的物种灭绝,但大熊猫却奇迹般存活下来并延续生存繁衍而被誉之为当今的“活化石”物种,且其对环境变化的适应性分子进化机制,也油然成为了学界的关注热点。主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC)是脊椎动物基因组中多态性极高的功能性基因家族之一,所编码的蛋白分子具有呈递抗原并激发免疫反应而使物种世代维持其应对环境变化能力的功能,为迄今开展脊椎动物环境适应性进化研究的主要分子标记。鉴此,本文在通过构建Ⅰ类MHC的BAC克隆重叠群而分离获得全部Ⅰ类MHC基因,并进一步建立这些基因的特异性基因型和单倍型的分型方法而终究搭建了Ⅰ类MHC分子完善的标记系统的前提下,完成了大熊猫野外6个山系的遗传变异、山系分化和适应性进化的多态性维持机制的研究工作。其相关的主要研究结果并附之微卫星(Microsatellites)中性分子标记的佐证检测参数的整合分析结论如下:(1)共筛选获得了16个包含Ⅰ类MHC基因的阳性BAC克隆。据此构建的两个BAC克隆重叠群的长度,分别为380kb和85kb。经GENESCAN预测,两个BAC克隆重叠群中共有6个Ⅰ类MHC基因,分别将其命名为Aime-C、 Aime-F. Aime-I. Aime-K、 Aime-L和Aime-1906.(2)组织表达检测和cDNA的全序列分析表明:Aime-C、 Aime-F、Aime-I和Aime-L均具有广泛的组织表达和正常的外显子结构,为经典的Ⅰ类MHC基因。而Aime-K和Aime-1906则为特异的组织表达,且外显子7的结构异常,为非经典的Ⅰ类MHC基因。(3)建立了Aime-C、 Aime-F、Aime-I和Aime-L4个经典的Ⅰ类MHC基因的外显子2和外显子3的特异性基因型分型,以及外显子2-3的单倍型分型的方法。该方法经已知大熊猫圈养家系的分型验证,表明其准确有效。(4)对随机采自6个山系的218只野生大熊猫的DNA样品进行群体检测与分析后,发现除Aime-F基因为单态之外,其余的Aime-C、 Aime-I和Aime-L基因均为多态,且3个多态基因共含有23条单倍型序列:Aime-C9条、Aime-I7条和Aime-L7条。相对于其它的濒危食肉类动物,大熊猫的Ⅰ类MHC基因具有中度水平的遗传多态性。(5)所获得的1)3个多态性基因抗原结合区的非同义置换率高于同义置换率、2)与相比,所揭示的种群分化程度较中性标记的结果为低,以及3)不同山系种群共享多数等位基因的结果,表明大熊猫的Ⅰ类MHC基因为平衡选择的进化模式。(6)整合Ⅰ类MHC基因与微卫星的检测分析结果,发现秦岭山系的大熊猫与岷山、邛崃、大相岭、小相岭和凉山等其它5个山系的大熊猫之间,已出现了显著的遗传分化(P(MHC)=0.004; P(microsatellite)=0.010),从而自环境适应性进化的角度,支持了秦岭山系为大熊猫的一个独立亚种的分类学结论。同时,在四川亚种所属的5个山系种群中,岷山山系与邛崃山系进化形成了一个复合的遗传单元——“岷山-邛崃”单元,而大相岭山系、小相岭山系和凉山山系则进化形成了另一复合的遗传单元——“大相岭-小相岭-凉山”单元。鉴此,本文建议将野生大熊猫划分为“秦岭”、“岷山-邛崃”和“大相岭-小相岭-凉山”等3个独立的遗传管理单元予以保护和管理。关键字:大熊猫;Major Histocompatibility Complex;平衡选择;山系分化。