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目的枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)是枸杞发挥免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、肝保护等作用的重要成分。树突状细胞(dendritic cell,DC)是功能最强大的抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs),是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。现有研究表明,枸杞多糖可以诱导树突状细胞成熟。但是目前不同分子量的枸杞多糖对树突状细胞成熟的影响仍不明确,尚有待进一步的研究。本研究采用水提醇沉法获得枸杞多糖后,经过膜透析得到五种不同分子量的枸杞多糖片段(LBP1、LBP2、LBP3、LBP4和LBP5)。体外培养树突状细胞,即利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)及白细胞介素-4(intreleukin-4,IL-4)诱导骨髓干细胞分化而来。将分离得到的四种易溶于水的多糖(LBP2、LBP3、LBP4和LBP5)刺激DCs,检测培养基上清中一氧化氮(nitric oxide,NO)及细胞因子 IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ 和 TNF 的含量变化,初步筛选出对DC有较好活性的多糖片段。将筛选出来的活性多糖片段继续进行体内外实验,观察DC的形态变化,检测DC的表型、吞噬功能,以及多糖刺激后DC对同种异体淋巴细胞增殖的影响,进一步验证该多糖片段的功效。并通过检测核转录因子p65(nuclear factor kappa B p65,NF-κB p65)的表达,探讨该片段促进DC成熟的分子机制。方法1.采用含有 10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的 RPMI-1640 培养基,GM-CSF和IL-4联合刺激培养小鼠骨髓细胞的方法,收集培养至第8天的半悬浮细胞,采用流式细胞仪检测CD11c阳性DCs的比例,复制培养iDCs的条件。2.采用Griess法,检测LBP刺激DC 24h后培养上清的NO浓度。3.采用流式细胞微珠阵列法(cytometric beads array,CBA),检测LBP刺激DCs 24h后的培养上清的IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ和TNF的浓度。4.采用显微镜观察LBP刺激DCs 24h后,DCs的形态变化。5.采用流式细胞术检测LBP对DCs表面分子CD11c、MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表达,观察LBP对DCs的成熟的影响。6.采用MTT法,检测LBP刺激后的DC对同种异体脾淋巴细胞增殖的影响。7.采用流式细胞术检测LBP对DC的吞噬功能的影响。8.采用Western blot实验,检测LBP对DC核内的NF-κB p65表达的影响。9.采用流式细胞术,检测LBP对未成年小鼠脾脏和肠系膜淋巴结DC成熟的影响。结果1.细胞培养实验结果显示,采用GM-CSF 10ng/mL和IL-4 1ng/mL条件,培养至第8天的半悬浮DC中,CD11c+DC比例为82.1%。2.NO检测结果显示,LBP3、LBP4和LBP5均能促进DC分泌NO,呈现剂量依赖性。其中在相同的浓度刺激下,LPB3刺激DC释放NO的效果最为明显。3.细胞因子检测结果显示,LBP3和LBP5都能促进DC分泌IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-y和TNF;LBP4能促进DC分泌IL-6、MCP-1和TNF。LBP3促进DC分泌细胞因子的效果优于LBP4和LBP5。4.显微镜观察结果显示,LBP3刺激后的DC,细胞边缘有较多的褶皱,呈现出枝杈状。5.DC表型检测结果显示,与对照组比较,LBP3各剂量组均能有效提高CD11c+MHC-Ⅱ+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+DC 比例,且上调 CD11c、MHC-Ⅱ、CD80 和 CD86 平均荧光密度(mean fluorescence intensity,MFI)的表达。6.混合淋巴细胞反应结果显示,经过LBP3刺激DC 24h后,DC与脾淋巴细胞共培养,发现DC可促进脾淋巴细胞增殖。7.吞噬荧光微球结果显示,与对照组比较,LBP3各剂量组DC的吞噬率和吞噬指数呈现下降趋势。8.Western blot实验结果显示,LBP3可以提高DC核内的NF-κB p65的表达。9.体内实验结果显示,与对照组比较,LBP3提高了小鼠脾脏CD11c+MHC-Ⅱ+、CD11c+CD86+DC 的比例。结论不同分子量枸杞多糖片段在诱导DC成熟方面表现出不同的活性。NO和细胞因子的检测结果显示,LBP3、LBP4和LBP5均能诱导DC成熟,其中以LBP3诱导DC成熟效果最为显著。体外实验结果显示,LBP3可能是通过激活NF-κB信号通路诱导DC成熟。体内实验显示,LBP3能诱导小鼠脾脏DC成熟。提示LBP3可能具有潜在的抗肿瘤应用前景。