研究目的：血管支架后的再狭窄(RS)是困扰着支架治疗的主要难题，有关RS的研究在基础和临床方面已经做了大量的工作，未能找到有效的抑制方法。细胞凋亡作为细胞死亡的主要途径之一，在维持细胞动态平衡中起重要作用。我们先前的实验结果证实，在金属支架植入后，新生内膜增生的同时，也有大量的SMC的凋亡发生，说明促进细胞凋亡可能有助于降低新生内膜增生。加热作为一种物理刺激，能够导致细胞凋亡或坏死，在实现了支架的非接触性加热研究后，本研究从体外细胞培养方面，来探讨加热对兔SMC的影响、加热诱导凋亡的温度范围和加热时间，以及加热诱导凋亡的通路和凋亡相关基因的表达，为下一步的动物实验和临床研究提供依据。 实验方法：采用原代平滑肌细胞培养的方法，对培养的平滑肌细胞进行加热，温度为37℃—54℃，加热10 min，继续培养，测定如下指标：(1)光镜观察不同培养时间的细胞形态改变；(2)台盼蓝鉴定细胞是否失去活力；(3)电镜和扫描电镜观察细胞的超微结构变化；(4)Annexin-V试剂盒测定细胞膜表面PS的变化；(5)流式细胞仪测定Annexin-V标记的细胞。(6)Caspase-3试剂盒测定Caspase-3的表达活性：(7)DNA电泳检测凋亡细胞的DNA片段形成；(8)DNA芯片技术检测加热诱导凋亡时，凋亡相关基因的表达情况。 结果：(1)在温度小于44℃时，细胞的形态与正常相比基本无变化，培养液中也无脱落细胞，细胞生长也未受抑制。在46℃、48℃、50℃时，在随后培养10小时后，细胞开始呈圆形或椭圆型回缩，细胞浆呈串珠样改变，培养24小时，培养的细胞全部呈圆形回缩，培养液中也见大量脱落的圆形细胞；在52℃、54℃时，细胞不回缩，培养10小时后，部分培养的细胞可见边缘翘起并呈碎片状脱落，12～24小时碎片状脱落达到高峰，脱落到培养液中的细胞形态也为片状，无呈圆形回缩样改变。在46℃以上的温度，培养液中脱落细胞的总数比44℃时急剧增多，而脱落细胞中被台盼蓝着色的细胞数，则在50℃时急剧增加，说明在44℃-50℃的温度范围内，脱落的细胞尚未失去活力，而＞50℃的温度，则细胞均被台盼蓝染色，且形态学上不再发生改变，为细胞坏死。(2)正常培养的细胞中，无Annexin-V标记细胞。44-46℃时，光镜下可以见到细胞回缩，但无典型的Annexin V标记荧 李春江博士后出站报告 光图像，只有少数细胞被标记；52度时，SMC被PI染色成红色。流失细胞仪也未 测到 Annexin V标记的细胞。（3）Caspase－3（半耽天冬酶）检测结果发现，44－48 ’C时，Caspase－3浓度比37C和52’C时有所增高，峰值在46oC，孵育10 ．J’时，孵 育24 ’J’时后，Caspase－3均低于正常对照。（4）DNA电泳显示44oC和46C孵育10 ’J’时时，出现了典型的 DNA梯带，52 ’C为 smear带。了该温度范围时，出现了典型 的洲A梯带（DNA ladder）。（5）电镜观察发现在46℃时，细胞典型的凋亡改变， 染色质浓缩，位于核边缘，圆形和新月型，并可见到凋亡小体形成，52 oC时细胞呈 坏死改变。（6）基因芯片显示加热 46 oC时，细胞膜信号传递的重要基因 DED（死亡 感受区域）的mRNA低表达，与炎症有关的基因LAMP－Zb（溶酶体膜相关蛋白－Zb） 的nRNA低表达。与凋亡有关的高表达的基因10个，表达增高3－4倍，特别是DFF40 （DNA片段因子40）的mRNA表达增高10倍，说明46oC加热处理时，有大量的凋 亡相关基因表达发生改变。 结论：（）通过体外非接触性电磁加热的方法，可以使金属支架温度升高， 升高的范围在40－100℃。（2）加热 10min诱导凋亡的温度为 44－48oC，42℃及以下 对培养的SMC没有致死性影响，50C时，凋亡和坏死并存，大于52oC时细胞全部 发生坏死。（3）加热诱导凋亡时，在加热后孵育10时，凋亡的关键酶caspase－3 随温度的不同而呈抛物线样改变，在46℃时升到最高点，但数值役有成倍的增加。 在加热后孵育24时，caspase－3均低于对照。加热诱导凋亡过程中有。aspase－3 的参与，其起作用的程度尚待深入的研究。（4）在本研究的条件下，Annexin－V不 明确，较少标记到典型的PS外翻细胞，结合DED基因表达的降低，可能加热破坏 了Annexin－V的结构，加热诱导的凋亡途径不是来自于细胞膜的信号。（5）加热损 伤了线粒体，电镜见线粒体的肿胀，这一途径可能参与加热诱导的凋亡。（6）加热 可直接影响到DNA，启动与洲A酶切有关的酶，特别是洲A片段因子基因（DFF40） 的表达明显增高，证明细胞核的途径在加热诱导凋亡中可能起重要的作用。