背景和目的再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)是一种常见的骨髓衰竭症,其病因多样、发病机理复杂。造血微环境缺陷是导致再生障碍性贫血发病的机制之一。尤其是骨髓基质细胞之一的间充质干细胞的缺陷很可能是导致再生障碍性贫血发生的重要环节之一;再生障碍性贫血的治疗除雄激素、免疫抑制剂以外,造血干细胞移植是非常重要的手段,但供体细胞来源的不足和严重的移植物抗宿主病(GVHD)是阻碍这种技术开展的重要障碍。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)的特点为该类细胞共有的自我更新、复制能力以及多向分化潜能,可进一步分化为造血细胞,并且可以支持造血、调节免疫功能,是骨髓造血微环境的重要组成成分。间充质干细胞具有低的免疫原性和可移植性,正在逐步成为细胞治疗的重要种子细胞。间充质干细胞和造血干细胞共移植可以促进造血干细胞植入、减少GVHD的发生。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)作为一种细胞因子具有促进细胞生长作用,同时对血管生成、细胞分裂等均有影响,还可以对造血干、祖细胞向造血部位(骨髓)迁移起着促进和诱导的作用。表达HGF的相关基因可以通过腺病毒等载体转染入间充质干细胞内,使间充质干细胞表达HGF增多,多数的研究表明HGF基因的修饰对间充质干细胞促进细胞修复、调节免疫等方面功能有增强的作用。但HGF基因修饰的间充质干细胞对造血功能的影响方面的研究却比较少。本研究的目的是在我院前期临床经验的基础上,通过动物实验探讨人脐带来源间充质干细胞(Human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UMSC)对再障模型小鼠造血功能的影响、HGF和间充质干细胞在对再障模型小鼠造血功能的影响上是否有协同作用,HGF基因修饰的间充质干细胞系的构建和其在再生障碍性贫血临床治疗中的潜在的价值。材料与方法第一部分:回顾性分析新乡医学院第一附属医院血液科2009年1月至2014年12月重型再生障碍性贫血(SAA)接受人脐带来源间充质干细胞联合外周血干细胞共移植病例6例,其中SAAⅠ型2例,SAAⅡ型4例,移植前均接受环孢菌素(CSA)及雄性激素治疗并不同数量输血,供者均为HLA配型6/6全相合同胞,其中男性供者4例,女性供者2例,血型不合1例。预处理方案为经典“环磷酰胺+ATG”的基础上加氟达拉滨;短疗程氨甲蝶呤(MTX)加环孢菌素预防GVHD;患者住无菌的移植病房;注意加强支持治疗。0天输注外周血干细胞CD34+细胞4.18(2.75-6.46)×106/kg(患者)输注造血干细胞前4小时输注人脐带来源的间充质干细胞2.71(2.4-3.0)×1010个。观察预处理方案不良反应,输注造血干细胞过及间充质干细胞过程是否是顺利;造血功能恢复时间的观察;GVHD及其他并发症发生的情况以及供者干细胞植入情况。第二部分:我们通过贴壁培养法,获得人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells、h UMSC),通过流式细胞仪检测间充质干细胞的表面抗原标志、通过诱导成神经细胞分化和成脂肪分化来鉴定间充质干细胞的特性。应用携带HGF基因的腺病毒载体(Ad-HGF)转染间充质干细胞,MOI为150 pfu/细胞,转染时间48小时。应用免疫标记法(Western blot)及酶联免疫吸附法(ELISA)检测转染后人脐带来源间充质干细胞HGF的表达。同时通过流式细胞仪对表面标志进行相应的检测,应用成神经细胞和成脂肪分化过程来检测Ad-HGF转染对人脐带来源间充质干细胞的影响。第三部分:我们将24只BABL/C小鼠分为实验对照组、h UMSC组、Ad-HGF修饰MSC组,应用6MV的X线均匀照射各组小鼠,照射后第2、4、6天,给每只小鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg、氯霉素62.5mg/kg。造模后第8天MSC组经小鼠尾静脉给h UMSC悬液注射含细胞数5×107个、Ad-HGF修饰MSC组经小鼠尾静脉注射Ad-HGF修饰的MSC悬液0.2ml含细胞数5×107个,并于注射后第2天应用ELISA法检测模型小鼠外周血中HGF的含量。实验对照组等量注射生理盐水。造模后每天观察小鼠一般情况同时测量体重等指标。造模后第8天取血观察三组血常规变化、同时取骨髓行骨髓涂片、骨髓活检的检查;濒死小鼠及死亡小鼠解剖观察;观察造模后第21天血常规,评价小鼠再障模型的稳定性及3组小鼠造血功能变化及恢复的程度。三组数据对比采用统计学T检验方法。结果第一部分:6例患者均顺利植入,3个月时评价均为100%供者型,白细胞中位恢复时间12d,血小板中位恢复时间16d。移植过程顺利,人脐带来源的间充质干细胞输注过程中患者无不良反应,无急性移植物抗宿主病(GVHD)发生,无其他严重并发症发生。第二部分:我们通过贴壁培养法获得的获得人脐带来源的间充质干细胞均呈贴壁生长的成纤维细胞样形态,表型特征分析显示细胞为非造血细胞群,转化试验证明细胞具有体外成神经细胞和成脂肪能力,说明获得的细胞符合MSC的特性。我们应用携带HGF基因的腺病毒载体(Ad-HGF)转染间充质干细胞,通过检测其表面标志及分化能力均不受影响。通免疫印迹法和酶联免疫吸附法检测的转染后间充质干细胞表达的较未转染组HGF增高,差别有统计学意义。第三部分:3组试验小鼠应用X线及化学药物造模,在造模后发现小鼠活动减少,摄食减少、体重下降,试验对照组1例死亡。造模后第8天,血常规检测发现,注射间充质干细胞2组小鼠白细胞、红细胞、血小板下降均较实验对照组轻,差别有统计学意义;Ad-HGF转染MSC组较MSC组上述指标高,但无统计学差别。骨髓涂片及骨髓活检均见造血组织减少、脂肪细胞增多现象。但Ad-HGF转染MSC组及MSC组病理变化较实验组轻。观察至21天各组白细胞、红细胞、血小板数量均处于低水平,但MSC组和Ad-HGF修饰MSC组恢复较好。结论第一部分:人脐带来源的间充质干细胞联合外周血干细胞共移植治疗重型再生障碍性贫血安全无相关不良反应,造血恢复良好,急性GVHD发生率低。第二部分:贴壁培养方法获得的人脐带来源间充质干细胞经检验符合MSC的各项特征;携带HGF基因的腺病毒载体(Ad-HGF)转染的间充质干细胞表面的各种标志的表达、转化成其他细胞的功能等特征不受影响。第三部分:X线及环磷酰胺、氯霉素联合构建小鼠再生障碍性贫血模型符合临床再障特点,血常规及骨髓变化符合典型再障表现。实验动物死亡率低。模型稳定持久。人脐带来源间充质干细胞及Ad-HGF修饰的人脐带间充质干细胞对再障模型小鼠的造血功能均有保护作用,修饰后的间充质干细胞此保护作用略强,提示HGF与间充质干细胞对再障模型小鼠造血功能可能有协同作用,需进一步研究证实。