前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)是组织激肽释放酶家族成员之一,具有丝氨酸蛋白酶、类胰蛋白酶和类酯酶活性。1979年Wang和其同事首次从前列腺组织中提纯了PSA,并揭示了PSA与前列腺癌的相关性。自被用作诊断前列腺癌的肿瘤标志物,其在前列腺癌筛选、诊断和术后监测中发挥了巨大作用。目前应用于临床诊断和治疗的PSA都是从精液中提取,这种方法材料集取繁琐,无法大批量生产,而且价格昂贵,不能适应广泛的市场需求;而且最关键的材料——精液,可能存在细菌、病毒、霉菌等潜在传染原。因此建立一种基因工程制备PSA的方法十分必要。大肠杆菌由于具有安全性好、遗传学生理学特性明确、生长周期短、操作简单、易于获得高表达等优点而成为主要工程菌。但大多外源基因在E .c o li中表达时往往以不溶性包涵体形式存在,需经一系列变性、复性过程才能得到可溶性蛋白,而且复性再折叠方法复杂、收率低、成本较高,经复性的蛋白活性一般较低。因此,如何获得外源蛋白在原核系统中的高效可溶性表达成为关键。造成重组蛋白在大肠杆菌中形成包涵体是由于动力学能障的存在,使部分折叠产物或具有裸露疏水表面的折叠中间产物发生聚集。折叠中间产物的这种自身缔合趋势造成蛋白聚集,形成包涵体。为了避免错误折叠导致折叠中间产物聚集而形成包涵体,得到天然蛋白分子,人们将目光转到寻求可溶性表达载体的构建上。为了克服包涵体的形成,常在表达外源基因的同时,共表达分子伴侣,以防止新生肽链自身聚集。由于分子伴侣可以降低动力学能障,阻止多肽链之间因正电疏水区短暂暴露发生不正确作用而防止错误折叠;或将错误折叠解开而形成正确装配。因此利用融合表达载体可以得到可溶性融合蛋白。本实验基于以往研究基础,利用二硫键形成蛋白(disulfide bond formation protein,Dsb)家族中的S1、S2与目的蛋白构建融合表达载体pET-S1-S2-PSA。S1具有催化二硫键形成和引导蛋白周质腔定位的功能,S2作为分子伴侣可在很大程度上提高外原蛋白的表达量。通过PSA与S1-S2融合表达,实现了PSA融合蛋白在大肠杆菌中高表达量、高活性、上清形式表达。实验结果证明S1-S2串联而共同作为分子伴侣具有很强的促进目的蛋白高效可溶性表达、维持目的蛋白生物活性的作用。原核生物的诱导条件对表达量和可溶性有很大影响,尤其是诱导的温度、诱导时IPTG浓度和诱导时间。我们通过不同温度、IPTG浓度和诱导时间对目的蛋白可溶性表达影响的研究,确立了在大肠杆菌OD600约0.5、29℃、IPTG浓度0.3mmol/L、诱导表达10h的诱导条件,获得了具有较高生物活性的目的蛋白,使目标蛋白的可溶性表达量达到最高。目标蛋白的纯化是蛋白质工程中非常关键的一个环节,其纯度和活性决定着整个工程的成败。本实验中,依据PSA融合蛋白的等电点,我们采用了阳离子交换层析的方法,选择pH值7.31缓冲液,在此pH值下,PSA融合蛋白带正电荷,可以和阳离子交换剂交换;而且比较接近人体正常体液pH值,有利于保持蛋白活性。用1mol/L NaCl洗脱后得到了纯度在90%以上的PSA融合蛋白。在Western Blot实验中,所纯化蛋白可很好的被商品化PSA抗体特异性识别,证明其具有较高生物学活性。由于良好的组织特异性,PSA被广泛地用于前列腺癌的检测、诊断和疗效观察。目前临床中最常用ELISA来检测血清PSA含量,而制作ELISA试剂盒的PSA抗体大多依赖进口,价格昂贵。本实验利用经纯化的可溶性PSA融合蛋白,与等比例弗氏完全佐剂FCA充分乳化后,于兔子脊柱两旁选8-10点皮下注射,每点注0.1ml,间隔10-14天后,再于上述部位选不同点注射(PSA融合蛋白与等比例弗氏不完全佐剂FIA充分乳化)加强免疫,共加强4次,每次免疫的抗原量约500μg。免疫5次后,颈动脉采血。成功的制备了PSA多克隆抗体,在Western Blot以及用天然PSA包被的ELISA中,PSA多克隆抗体可特异识别天然提取的PSA,说明该抗体活性及特异性均较好,在临床和实验研究中可部分取代进口产品,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。目前还没有PSA原核可溶性表达的报道,通过本实验研究,我们建立了PSA的可溶性大肠杆菌表达系统,获得了高活性重组人前列腺特异性抗原融和蛋白及其抗体,经实验证明其特异性和抗体效价均较高。为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料;同时也为探讨原核表达机制和实现规模工艺生产提供参考,为实现其它细胞因子或多肽类药物利用原核系统进行表达提供了模式。具有深远的应用价值和研究价值。目前在这方面仍有大量工作有待完成,相信人们今后在此方面的研究必将获得许多重大突破。