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蛤蚧作为名贵的中药材,其原动物为壁虎科动物大壁虎,已有2000多年的药用历史。近年来,由于环境的破坏和人类的捕捉,野生大壁虎的数量急剧下降。另一方面,蛤蚧作为一种常用中药材,市场需求量呈上升趋势。如此情形下,导致越来越多的蛤蚧伪品充斥市场。为了消费者的利益和中药材的质量监管,正确的蛤蚧鉴定方法势在必行。传统的蛤蚧鉴定方法主要是基于形态、显微及理化鉴定方法,但存在着明显的不足。分子生物学的发展为传统动物类中药材的鉴定提供了新的技术,较之传统方法,分子鉴定更为准确、快捷而凸显其优势(Joshi et a1.,2004)。其中,物种鉴定的前沿技术即DNA条形码(DNA barcoding),以其易于操作、准确、可标准化等特点在同领域得到了普遍的认同。
由此,本研究基于DNA条形码技术,选用蛤蚧及众多伪品为实验材料,尝试建立中药材蛤蚧的准确、简捷鉴定方法。此外,基于DNA条形码序列及药用亲缘学的理论,尝试对红、黑蛤蚧及其药效差异进行再评估。本论文共涉蛤蚧微型DNA条形码引物筛选、DNA条形码技术鉴定蛤蚧及伪品、DNA条形码一特异性PCR技术鉴定蛤蚧及伪品、基于DNA条形码序列的红黑蛤蚧药效再评估等四部分。各部分主要研究内容及结论简述如下:①蛤蚧微型DNA条形码引物筛选:
通过对自行实验获得的序列和GenBank上相关序列进行比对分析,筛选出适合于扩增蛤蚧及伪品微型DNA条形码引物。借助引物设计软件,经过多序列比对,设计了两对引物mini-barcode F2,mini-barcode R2:mini-barcode F3,mini-barcode R3,并用这两对引物和目前已报道的微型条形码引物PCR扩增蛤蚧及伪品61个样本。其中mini-barcodc F2,mini-barcode R2和mini-barcode F3,mini-barcode R3这两对引物的PCR扩增成功率分别为100%和90%。而目前已报道的微型条形码引物PCR扩增蛤蚧及其伪品得到了长度约500bp非微型条形码序列片段。由此得出目前已报道的微型条形码引物不适用于扩增蛤蚧及伪品,故本研究筛选出了适合于蛤蚧及伪品的微型条形码引物。②DNA条形码技术鉴定蛤蚧及伪品:
本研究使用DNA条形码技术鉴定蛤蚧及伪品,选择57个蛤蚧及伪品样本作为实验材料,实验扩增蛤蚧及伪品的标准条形码和微型条形码的序列,同GenBank上相关序列进行比对分析,发现蛤蚧同伪品间的序列差异明显高于蛤蚧种内差异(标准条形码:35% vs3%:微型条形码:33.5% vs4%)。结果表明标准条形码和微型条形码可有效的鉴定蛤蚧及伪品。③DNA条形码一特异性PCR技术鉴定蛤蚧及伪品:
以DNA条形码序列为基础,探讨DNA条形码一特异性PCR技术鉴定蛤蚧及伪品的可行性。选用自行扩增的16条DNA条形码序列为引物设计依据序列设计了一对DNA条形码一特异性引物COISF,COISR,同时从GenBank上下载30条序列,设计了 CytbSF,CytbSR:16SrRNASF,16SrRNASR:12SrRNASF,12SrRNASR三对DNA条形码一特异性引物,因此共用四对DNA条形码特异性引物分别扩增蛤蚧及伪品实验样本。在复性温度为65℃时,四对引物都出现了理想的结果,即蛤蚧正品出现了扩增条带,而伪品没有扩增条带。同时对市售的蛤蚧商品进行了检测,在所供的7号标本中,有4号为蛤蚧正品,其余3号为蛤蚧伪品。结果表明本研究所设计的DNA条形码一特异性引物可快捷、准确的鉴定蛤蚧及伪品。④基于DNA条形码序列的红、黑蛤蚧药效再评估:
基于DNA条形码序列信息,运用药用亲缘学原理,对红、黑蛤蚧药效情况进行再评估。获取DNA条形码序列信息,采用MP法构建系统发育树,基于系统发育树判断红、黑蛤蚧之间的亲缘关系,并依此探讨红、黑蛤蚧及药效之间的关系。实验结果表明红、黑蛤蚧在系统树上相互嵌合在一起,不能各自形成独立分支(单系),来自不同产地的红、黑蛤蚧分别构成了4个独立支系,这与红、黑蛤蚧截然可分的概念相悖。由此可知红蛤蚧可能具有和黑蛤蚧相似的药效,不同地区的红、黑蛤蚧药效可能存在差异。本研究可为红、黑蛤蚧的药效及化学成分研究提供前瞻性的建议,即开展相关研究应基于亲缘关系,分别对不同产地红、黑蛤蚧样品进行分析。