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研究背景及意义:支气管哮喘（简称哮喘）是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道疾病,以气道非特异性炎症、气道反应性增高及气道重建为主要特征。哮喘的发生与发展受多种基因的调控,从而决定淋巴细胞亚型,免疫反应性,嗜酸粒细胞（Eosinophils,EOS）及肥大细胞的迁移、活化、细胞因子合成、粘附分子表达及组织修复过程。尽管哮喘基础研究取得较大的进步,哮喘的治疗更多的还是依赖于糖皮质激素、β2肾上腺素受体激动剂等几类药物。评估哮喘的指标仍以肺功能指标、呼出气一氧化氮及诱导痰EOS为主,因此哮喘临床诊治策略仍有待进一步完善。EOS与哮喘气道炎症、免疫调控、上皮细胞损伤、上皮下基质沉积、气道阻塞及肺功能下降等密切相关。临床研究也显示诱导痰EOS可作为哮喘临床控制的有效指标。2006年全球哮喘防治创议（Global Initiative for Asthma,GINA）明确指出:EOS可能在哮喘气道重建过程中发挥重要作用,而气道重建很可能是未来哮喘治疗的新靶点。足够证据表明EOS活化在哮喘发生发展中起重要作用,但其活化具体机制尚未完全阐明。近年来也有多项研究观察到了EOS某些基因发生改变,但其更多的还是体外或者是观察单一通路在EOS调控的机制。基于这些问题及哮喘疾病的复杂性,选择体外或者单因素分析显得非常局限,而选择哮喘病人在不同病情状态进行基因表达谱分析有利于发现真正参与疾病发生发展相关的候选基因。因此本研究首先以哮喘患者不同时期EOS为主要对象进行基因表达谱的分析。在获得多种EOS差异表达基因后,因为氧化应激和EOS迁移是哮喘的重要特征。因此我们分别选择与哮喘氧化应激、细胞骨架重建相关基因硫氧还蛋白结合蛋白2/维生素D3上调蛋白1（Thioredoxin-binding Protein 2/Vitamin D3 Up-regulated Protein 1,VDUP1）、细胞骨架蛋白相关基因肌动蛋白解聚因子/丝切肌动蛋白slingshot磷酸酶2（SSH2L）进行进一步验证及功能分析,为未来针对炎性靶细胞治疗提供一定的理论依据。方法:1.哮喘患者外周血EOS cDNA消减文库构建及鉴定在1例明确诊断为哮喘患者急性发作时及缓解时分别提取外周血EOS总RNA,应用Super SMART cDNA synthesis和SSH技术,构建哮喘时EOS相关基因消减cDNA文库,测序、通过差异筛选（Differential Screening,DS）对部分阳性克隆进行筛选验证,并进行同源性对比分析。2.哮喘患者VDUP1和SSH-2L差异表达分析共选取正常对照10例和哮喘患者发作期15例和缓解期15例,提取患者外周血EOS总RNA,应用半定量RT-PCR和Western Blotting技术验证VDUP1和SSH-2L差异表达。3.VDUP1与EOS活化关系及其在哮喘中的作用研究对象来自于第二部分。留取患者诱导痰,测量诱导痰EOS%,用酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测患者血清嗜酸粒细胞阳离子蛋白（Eosinophil Cationic Protein,ECP）浓度。分析VDUP1表达与哮喘患者诱导痰EOS%、肺功能指标一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（ForcedExpiratory Volume in One Second to Predicted Value,FEV1%）、最大呼气流速占预计值百分比（Peak Expiratory Flow to Predicted Value,PEF%）及血清ECP浓度关系。4.硫氧还蛋白（Thioredoxin,TRX）氧化剂和TRX硫醇基烷化剂对EOS的VDUP1作用环节的影响以IL-5（EOS向肺部浸润、活化必需的细胞因子）刺激孵育正常EOS,同时用ELISA法检测血清和培养上清液ECP浓度。研究VDUP1表达对EOS功能影响;因VDUP1功能发挥主要依赖于与TRX氧化还原中心相互作用而完成,因此在孵育的细胞中,两组分别给予破坏TRX氧化还原中心的TRX氧化剂二酰胺和烷化剂2,4二氯二硝基苯,阻断VDUP1与TRX相互作用,通过观察VDUP1表达变化与上清液中ECP含量,初步探讨VDUP1与TRX相互作用及其参与EOS活化的可能机制。统计学分析采用SPSS 10.0软件的One WayANOVA和Bivariate orrelations方法,组间比较采用LSD方法检验。结果:1、成功构建上调、下调两个哮喘相关基因cDNA消减文库,经进一步差异筛选,同源性对比分析,筛选出与细胞骨架重建相关基因6个,包括SSH-2L,蛋白磷酸酶1催化亚单位β亚型,蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型6,蛋白酪氨酸磷酸酶非受体12,DOCk8,肌球蛋白轻链结合蛋白。与氧化应激及信号转导有关基因8个,包括VDUP1、高移动性蛋白2、水通道蛋白9、双重特异磷酸酶1、跨膜蛋白BRI、糖皮质激素受体结合蛋白1、SNF-1相关激酶、DICE1等。2、外周血EOS SSH2L相对表达量在哮喘发作组、缓解组及正常组分别为（1.648±0.68）、（0.918±0.395）和（0.876±0.436）,其中发作组显著高于正常组（n=5,P=0.038）与缓解组（n=5,P=0.047）,而缓解组基因表达与正常对照组无显著差异（P=0.901）;VDUP1mRNA相对表达量在发作组、正常组及缓解组分别为（0.228±0.117）,（0.674±0.171）,（0.699±0.138）,发作组表达比正常组与治疗组明显降低（P=0.001）,而相应蛋白相对水平分别为（0.348±0.147）,（0.402±0.121）,（0.422±0.163）,发作组蛋白水平也均显著低于正常组及缓解组（P=0.001）。正常组与缓解组在mRNA水平（P=0.655）和蛋白水平（P=0.623）均无显著差异。3、血清ECP浓度在哮喘发作组、哮喘缓解组及正常对照分别为（4.41±1.36）ng/ml,（14.3±4.29）ng/ml,（6.70±1.40）ng/ml,诱导痰EOS%在三组分别为（1.35%±0.35%）、（11%±4.8%）、（3.6%±0.89%）。统计相关性分析表明,VDUP1表达与诱导痰EOS%（r=-0.714,p=0.000）及血清ECP浓度（R=-0.735,P=0.000）呈显著负相关,而缓解组基因表达与对照组无显著差异。4、IL-5刺激下,EOS VDUP1表达显著降低（P=0.000）,同时伴上清ECP显著升高（P=0.000）。而应用破坏VDUP1作用环节的TRX氧化剂二酰胺和烷化剂2,4二氯二硝基苯并不影响IL-5对VDUP1表达的影响,但可使培养液上清的ECP浓度下降。结论:1、成功构建上调、下调两个哮喘相关基因cDNA消减文库,经筛选共获得6个与细胞骨架重建的相关基因和8个与氧化应激及信号转导相关基因,哮喘患者不同状态的EOS基因表达可能不同;2、SSH-2L基因在哮喘发作组外周血EOS显著高表达,表明SSH-2L可能在调控EOS迁移、趋化方面发挥重要作用;3、VDUP1表达可能与EOS活化有关;4、IL-5诱导EOS活化可能与TRX氧化还原及VDUP1表达下调有关.