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目的:既往对胰岛素的作用研究主要集中在代谢方面。临床观察发现在一些以高胰岛素血症或者胰岛素抵抗为主要特征的疾病患者中,胚胎着床能力下降、着床后流产率高。母体子宫内膜功能的正常维持对于胚胎发育十分重要。已有研究显示在高胰岛素的直接作用下胚胎发育异常,但其对母体子宫内膜的调控作用尚未见研究报道。随着子宫内膜容受性的建立,胚胎植入母体,紧接着母体子宫内膜发生蜕膜化,在胎盘形成以前担负着营养胚胎的作用。课题组前期研究发现在高胰岛素的作用下子宫内膜容受性受损、蜕膜化异常。子宫内膜蜕膜化过程中,一个重要的改变是血管生成与血管重塑。血管生成对子宫内膜的蜕膜化至关重要,它建立了一个复杂的血窦与血管网络系统,血管网络作为母体和胚胎之间的物质交换装置,对于正常妊娠的维持十分关键。研究表明高水平胰岛素对其他组织和器官的血管生成具有十分重要的作用,因此我们推测,高水平胰岛素可能也会参与调控子宫内膜蜕膜化血管生成。因此本研究旨在通过构建高水平胰岛素的动物和细胞模型,探讨高胰岛素对早孕小鼠子宫内膜蜕膜化过程中血管生成的影响及其可能的机制。方法:1.模型的构建与材料收集(1)高胰岛素小鼠模型构建:采用皮下注射胰岛素的方法构建高胰岛素小鼠模型。同时将高胰岛素小鼠(IN)与对照小鼠(CON)分别用于构建正常妊娠模型和人工诱导蜕膜化模型(AI)。(2)正常妊娠模型:分别将对照组和高胰岛素组雌鼠与正常成年雄鼠于下午18:00合笼(雌:雄,4:1),次日清晨检查雌鼠阴道有无阴栓,有阴栓者确定为妊娠第1天(D1)。于妊娠第6、7和8天(D6、D7和D8)收集血清及子宫组织进行相关检测,并检测血糖。(3)人工诱导蜕膜化模型:分别将对照组和高胰岛素组雌鼠与输精管结扎的雄鼠下午18:00合笼,次日清晨检查雌鼠阴道有无阴栓,有阴栓者确定为假孕第1天(PD1),在小鼠假孕第4天(PD4)早上9:00,将小鼠的一侧子宫注射芝麻油25μl(诱导侧),另一侧子宫不进行注射作为对照。于假孕PD8早上9:00收取人工诱导蜕膜化诱导侧子宫进行相关分析。2.子宫内膜蜕膜化标志分子的检测:采用Real-time PCR、Western-blot方法检测正常妊娠模型D6、D7、D8天孕鼠子宫内膜组织和人工诱导蜕膜化模型诱导侧小鼠子宫内膜组织蜕膜化标志分子BMP2、PRL的表达,免疫组化的方法检测正常妊娠小鼠孕D8天子宫内膜BMP2的表达。3.血管网络与管腔生成能力检测:免疫组化对正常妊娠小鼠模型D7、D8天孕鼠子宫和人工诱导蜕膜化模型小鼠诱导侧子宫进行血管标志分子CD34染色。管腔成型实验检测高水平胰岛素对人脐静脉内皮细胞(HUVECS)管腔成型能力的影响。4.血管生成相关因子表达检测:Real-time PCR检测正常妊娠小鼠模型D6、D7、D8天孕鼠子宫内膜组织和人工诱导蜕膜化模型小鼠诱导侧子宫内膜组织中VEGFA、VEGFR2、ANG-1、和TIE2的表达。Western-blot检测正常妊娠小鼠模型D6、D7、D8天孕鼠子宫内膜组织和人工诱导蜕膜化模型小鼠诱导侧子宫内膜组织中VEGFA、ANG-1、和TIE2的表达。免疫组化检测孕鼠妊娠D7、D8天子宫内膜VEGFA、ANG-1的表达。高胰岛素处理后Western-blot检测HUVECS细胞中VEGFA、ANG-1、TIE2的蛋白表达,免疫荧光检测HUVECS细胞中VEGFA表达。5.自噬相关检测:Western-blot检测正常妊娠小鼠模型孕D6、D7、D8天小鼠子宫内膜中自噬标志因子LC3、p62、Atg5、Beclin1、ULK1、p-ULK1的蛋白表达。免疫荧光检测HUVECS在高水平胰岛素作用下自噬标志分子LC3的表达改变。进一步运用自噬抑制剂3-MA抑制自噬后,管腔成型实验检测HUVECS的管腔成型能力,免疫荧光检测HUVECS中VEGFA的表达。结果:1.ELISA结果显示高胰岛素组孕鼠血清胰岛素水平相对于对照组显著升高(p<0.001),血糖水平明显增加(p<0.05),提示胰岛素妊娠小鼠模型构建成功。2.Real-time PCR结果表明,在高胰岛素的作用下妊娠D6、D7、D8天孕鼠子宫内膜组织BMP2、PRL m RNA表达显著降低(p<0.05)。Western-blot结果表明,与对照组相比较,高胰岛素处理组妊娠D6、D7、D8天孕鼠子宫内膜组织BMP2、PRL蛋白表达显著降低(p<0.05)。免疫组化结果同样显示,在高胰岛素的作用下孕鼠妊娠D8天子宫内膜BMP2表达显著降低。3.正常妊娠小鼠孕D7、D8天子宫CD34免疫组化染色结果显示,高水平胰岛素组和对照组之间血管密度并无明显差异,但高胰岛素组血管窦的尺寸明显小于对照组。人工诱导蜕膜化模型小鼠诱导侧子宫CD34免疫组化染色结果显示高胰岛素组血管窦尺寸也明显小于对照组。此外,在高胰岛素的作用下HUVECS细胞的管腔生成能力受阻。4.Real-time PCR结果表明,在高胰岛素的作用下妊娠D6、D7、D8天孕鼠子宫内膜组织VEGFA、VEGFR2 m RNA表达显著降低(p<0.05),但ANG-1、TIE2 m RNA表达显著增加(p<0.05)。Western-blot结果表明,与对照组相比较,高胰岛素处理组妊娠D6、D7、D8天孕鼠子宫内膜组织VEGFA蛋白表达显著降低(p<0.05),ANG-1、TIE2蛋白表达显著增加(p<0.05)。免疫组化结果同样显示,在高胰岛素的作用下孕鼠妊娠D7、D8天子宫内膜VEGFA表达显著降低,ANG-1表达显著增加。在高胰岛素的作用下假孕小鼠蜕膜化诱导侧子宫内膜VEGFA m RNA和蛋白表达均显著降低(p<0.05),ANG-1、TIE2 m RNA和蛋白表达均显著增加(p<0.05)。在高胰岛素的作用下HUVECS细胞中血管生成相关因子的表达也受到了干扰。Western-blot结果显示,高胰岛素处理的HUVECS细胞中VEGFA蛋白表达明显降低(p<0.05)、ANG-1、TIE2的蛋白表达显著增加(p<0.05)。VEGFA免疫荧光结果显示,在高水平胰岛素的作用下VEGFA在HUVECS中的表达受到了显著抑制。5.高水平胰岛素显著增加正常妊娠小鼠模型孕D6、D7、D8天子宫内膜中LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin1、p-ULK1的表达,同时显著降低P62的表达(p<0.05)。高胰岛素处理HUVECS细胞后LC3表达显著增加。与单独高胰岛素处理组相比较,采用自噬抑制剂3-MA干预高胰岛素处理的HUVECS后,原本受损的细胞管腔形成能力和VEGFA表达均得到改善。结论:血管生成是子宫内膜蜕膜化的重要过程,子宫内膜的血管生成是一个复杂的过程,受到多种因素的调控。本研究提示,在高胰岛素的作用下子宫内膜血管生成相关标志分子表达紊乱、血管窦的延伸与扩增受到抑制。自噬可能参与了高胰岛素所引起的子宫内膜蜕膜化过程中血管生成障碍这一过程,但其具体机制还有待进一步研究。