研究背景及目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)作为全球第六大常见的恶性肿瘤,具有疾病进展快、死亡率高的特点;在肿瘤相关死亡原因中HCC位居第三位,我国同样是肝癌的高发区,死亡率位于我国恶性肿瘤死亡率的第二位。然而值得注意的是,根据流行病学调查研究显示在原发性肝癌患者中,男性患者发病率要明显高于女性,发病率之比约为2-4:1。根据世界统计的数据显示,男性肝癌是第五大常见的恶性肿瘤,并位于肿瘤相关死亡原因的第二位。而女性中,居于第七大常见恶性肿瘤的疾病是肝癌,并位于肿瘤相关死亡原因的第六位。近年来,大量相关的研究已证实雄激素受体(Androgen recepator,AR)是导致肝癌性别差异性的重要因素。研究发现在肝癌细胞系及肝癌组织内均可检测出AR的高表达,并可通过调节HCC中某些与细胞增殖、生长和转移相关分子的表达及活性。在疾病的早期阶段,AR表现一个明显的致瘤性;然而在肝癌晚期阶段,AR则表现为一个抑制作用。此外,有文献报道显示AR的表达常导致Wnt信号通路的异常表达,以及β-catenin的表达升高,从而促进HCC的发展。细胞循环相关激酶(cell cycle-related kinase,CCRK)是细胞周期蛋白依赖性激酶家族的成员(CDK20),在人类多种肿瘤中均有表达。有研究通过分析HCC患者的临床组织样本中发现CCRK与AR之间存在一定的关联,且与患者较差的预后具有相关性。CCRK是AR的一个重要的下游调节区,可由配体激活的AR促进转录,并通过介导β-catenin通路的激活而促进肝癌的发生。雄性生殖细胞相关激酶(Male Germ Cell–Associated Kinase,MAK)是一种与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶密切相关的激酶。最早发现在成人睾丸生殖细胞及在精子形成的减数分裂阶段中均存在特异性高表达;同时在前列腺、视网膜、肾等组织中也检测出高表达,而在肝组织中则无明显表达。近年来,研究证实MAK是雄激素受体(AR)的直接转录靶点及辅激活蛋白,并可激活AR的反式激活力。此外,有学者提出MAK与CCRK同样存在一定的相关性,MAK作为CCRK的下游调控区,当CCRK过表达时,可促进MAK的双重磷酸化;研究发现在恶性胶质母细胞瘤中,CCRK通过激活MAK活力的作用,从而使纤毛长度得到恢复,进而抑制肿瘤的发展。因此综上所诉,MAK同时作为AR及CCRK的下游调节区,在肿瘤的发展中均扮有重要的作用。然而,MAK的表达是否对肝癌产生影响,目前仍不清楚;虽然关于MAK在肝癌中的研究仍较少,但我们推测MAK同样对肝癌产生影响并与预后相关,因此需要我们进一步探讨。在本研究中,我们采用Realtime-PCR、Western blot、免疫组织化学检测MAK是否在HCC的不同细胞系及组织中存在表达、并从以下两个方面进行探讨:(1)分别检测HCC肝癌细胞系及组织中MAK的表达,分析MAK表达的差异与患者预后的相关性。(2)通过分别构建稳定低表达MAK(sh RNA-MAK)及过表达MAK(High-MAK)的肝癌细胞,分析其对肝癌产生的影响。研究方法和结果第一部分探讨MAK在肝癌中的表达并分析与患者临床预后的相关性在本研究的第一部分,我们首先分别收集LM3、SMMC-7721、Huh-7、Hep-G2等肝癌细胞系及LO2细胞的RNA,并通过Realtime-PCR检测MAK-m RNA是否在肝癌细胞中存在表达。结果显示:4种肝癌细胞系均有检测出MAK-m RNA的表达,且均高于正常肝LO2-m RNA表达水平;其中LM3表达的MAK-m RNA水平最高,而Hep-G2表达的MAK-m RNA水平较低。接着,利用Western-blot验证这四种不同的肝癌细胞中MAK的蛋白表达是否存在。我们发现4种肝癌细胞系中同样存在MAK的蛋白表达,而LM3的MAK蛋白水平表达较高。然后,我们利用免疫组化染色检测肝癌组织及正常组织中是否存在MAK表达;结果显示MAK阳性染色存在细胞核中,显微镜下显示细胞核棕色染色,而在正常的肝组织中未见MAK明显染色。在进一步实验中,我们通过收集在我院接受肝癌根治性手术切除的141例患者的临床资料,并通过提取患者肿瘤组织RNA,利用Realtime RT-PCR分别检测肿瘤组织中MAK-m RNA的表达水平,同时结合术后随访资料、了解患者生存情况,并采取Kaplan-Meier及Cox多因素分析患者的生存预后。结果显示:141例HCC中,70例(49.6%)为MAK低表达,71例(50.4%)为MAK高表达。其中,在MAK高表达中,男性57例、中位生存期为25个月;女性14例,中位生存期17个月;单因素及多因素Cox分析结果表明HCC组织中MAK的高表达是影响患者预后的独立危险因素,在MAK表达水平较高的患者中,其无瘤生存期及总生存期均差于MAK表达水平较低的患者。因此,我们推测,MAK的表达在HCC的发展过程中具有一定的影响,然而具体的机制需要我们进一步探讨。第二部分探讨MAK对肝癌产生的影响及其机制在此部份我们主要探讨MAK对HCC发展过程中产生的作用以及探讨可能的机制。首先,我们使用慢病毒转染构建稳定低表达的sh RNA-MAK LM3细胞和过表达MAK的SMMC-7721细胞后,通过划痕实验、Transwell方法用来检测MAK的不同表达水平对LM3及SMMC-7721细胞侵袭能力的影响,我们发现在由过表达MAK处理后的SMMC-7721细胞中,明显提高了细胞的侵袭转移,而sh RNA-MAK处理组中,LM3的侵袭转移能力则减弱。同时使用细胞免疫荧光、Western blot、RT-PCR分别检测过表达组和干扰组细胞中上皮细胞标志物E-cadherin、间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin和EMT相关转录因子Snail的表达变化,我们发现过表达MAK后,可以促进EMT的发生,而sh RNA-MAK表达则会抑制肝癌细胞的EMT。结论综上所诉,我们结合二部分研究结果,总结得出下列结论:1.MAK在肝癌细胞及其组织中均存在表达,并且与患者的预后存在相关性;在MAK表达水平较高的肝癌患者中,其生存预后要差于MAK表达较低的肝癌患者。2.MAK可以提高肝癌细胞的迁移、侵袭转移能力,并可促进EMT的发生。