旋毛虫病（trichinellosis trichinosis）的病原体是旋毛形线虫（Trichinellq spiralis）简称旋毛虫，寄生于猪、野猪、鼠、熊等150种动物和人体内，成虫和幼虫分别寄生于同一宿主的小肠内。旋毛虫病是因为生食或半生食含有旋毛虫幼虫囊包的猪肉和其他动物肉类而感染，本病是世界上较常见的人兽共患病。不仅严重危害人类健康，而且对养猪业可造成巨大损失。近年来在我国17个省、市、自治区发现有多起人体感染的暴发流行。河南省为我国旋毛虫病高发区之一，仅郑州市已发生7次暴发流行，发病400多人。若不及时诊断和治疗，患者死亡率可高达3%一30%。因而旋毛虫成为我国肉食品卫生检验中的首检寄生虫，开展旋毛虫病的预防和控制工作在我国更具紧迫性和重要性，而预防和控制旋毛虫病的关键在于建立一套快速、简便、特异性高的检测手段以及采取各种有效预防措施降低动物感染率。对旋毛虫病的免疫预防的研究表明，由于旋毛虫在不同的发育期虫体抗原组分存在明显的差异并且在同一期虫体抗原结构也极其复杂，在长期寄生生活中，逐渐形成了免疫逃避机制，所以目前采用成份复杂的虫体抗原往往难以取得理想的免疫预防效果。旋毛虫抗原具有其特异性，成分极其复杂，并且不能在体外进行培养和繁殖，而且其临床表现较为复杂，因此给旋毛虫病免疫诊断及预防带来困难，故寻找旋毛虫特异性抗原基因就成为我们工作的重点。而构建cDNA文库，采用免疫学方法钓取cDNA片段，从而分析抗原蛋白的抗原表位，选取最佳抗原，是研究旋毛虫抗体的有效途径之一。目的：收集纯净的5日龄旋毛虫成虫，建立旋毛虫成虫cDNA文库并对旋毛虫增殖细胞核抗原PCNA基因进行克隆和测序，测序结果与GenBank中的PCNA基因序列比较。构建旋毛虫增殖细胞核抗原基因原核表达载体，用IPTG的方法诱导其表达目的蛋白，并用Westen鉴定其功能。方法：收集纯净的旋毛虫5日龄成虫，提取旋毛虫成虫的RNA，进一步建库。根据GenBank中登录的PCNA基因的序列设计引物，用PCR的方法从旋毛虫成虫基因库筛选这一基因，得到的PCR产物与pUM-T载体连接，转化到感受态细胞DH5a进行测序和同源性比较。分别抽提表达载体PET32a及目的基因的质粒，通过BamHI和HindIII双酶切并做产物回收的方法得到具有酶切位点的表达载体，从而连接目的基因及表达载体，构建表达重组体，将构建好的表达性重组体转化入感受态BL21。通过IPTG诱导表达出目的蛋白，经Westen鉴定此蛋白的功能。结果：1提取旋毛虫成虫RNA：在胶上可以清晰的看到28S,18S,5S三条条带，条带亮度较好，无明显降解现象，说明RNA的完整性较好，可进行cDNA的合成，可用于文库构建。凝胶电泳图片发现，旋毛虫的18S rRNA条带亮度明显高于28S rRNA条带亮度，约为2倍，经多次重复，结果一致。2构建旋毛虫成虫cDNA文库：经过两次杂交和两次PCR，把所得到的cDNA文库进行电泳检测分析。3扩增出PCNA基因：以构建的旋毛虫cDNA文库为模版，用PCR的方法扩增出PCNA基因，其大小约为804bp。克隆基因与GenBank登录的增殖细胞核抗原的基因同源性为94%。4表达载体的构建：抽提表达载体pET32a的质粒，用BamHI和HindIII对表达载体pET32a进行酶切并做产物回收，得到了表达载体构建。5pET32a-PCNA重组表达质粒的鉴定：用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒后得到2500bp和804bp左右两条片段，与预期结果相符，表明pET32a-PCNA原核表达载体构建成功。6重组表达质粒pET32a-PCNA的表达：表达产物进行SDS-PAGE后，在30kD位置处可见明显的蛋白质条带。7Western blot做功能鉴定：用感染了旋毛虫的小鼠血清做一抗，得到明显的条带，从而鉴定了PCNA的抗原性。结论：1构建了云南株旋毛虫成虫cDNA文库；克隆了PCNA基因。2构建了云南株旋毛虫增殖细胞核抗原基因的原核表达载体。3表达了PCNA蛋白。4用Western的方法验证了增殖细胞核抗原的抗原性。