有研究表明近年来脑卒中在中国的发病率每年增加9%,并且已经成为中国的首要致死原因之一。脑卒中的致死致残率高,会给个人和社会带来沉重的负担,还会对社会经济产生巨大的影响（特别是中低收入国家）。而缺血性卒中占所有脑卒中的80%。近几年来,急性脑梗死的血管内治疗取得了突破性的进展,而其治疗效果及预后与初次就诊时选择的治疗方式有密切关系。除了关注其起病时间外,医生更需以影像学检查精准评估脑缺血所造成组织损伤的程度以选择具体的治疗方式。目前主要是以灌注MRI及灌注CT来获取这方面的信息,但这二者并不完美,各有其不足之处。这促使学术界进一步寻找脑梗死的可靠生物标志物以辅助诊断、指导治疗及判断预后。近年来非编码RNA的研究取得了一些进展,尤其是lnc RNAs更成为学术界关注的热点。lnc RNAs是长度大于200核苷酸的非编码RNA。研究发现其在转录、转录后、表观遗传等多个层面调控生物学进程,它可能以屏蔽基因转录的起始区域、屏蔽转录因子结合位点、促进转录因子与其特异的结合位点之间的结合等方式起调控作用。研究发现一批lnc RNAs可以作为多种疾病（以肿瘤为主）的生物标志物,其中一部分还可以调控其功能。目前有研究初步显示lnc RNAs与脑梗死关系密切,但对其二者关系的研究还处于早期阶段。有理论认为急性脑梗死后脑组织中炎症因子、活性氧自由基的增多会使脑微血管内皮细胞紧密连接退化,破坏血脑屏障的完整性,脑梗死后神经细胞中高表达的核酸可以通过崩解的血脑屏障进入外周血。因此,我们假设脑梗死后的外周血中发生明显变化的lnc RNAs有一部分是在神经细胞中特异高表达的,其有作为脑梗死生物标志物的潜力,而脑梗死标志物中可能包含了参与脑梗死后功能调控的lnc RNAs。本研究的主要目的有二:1、研究外周血差异表达的lnc RNAs作为急性脑梗死生物标志物的诊断价值;2、研究神经细胞中差异表达的lnc RNAs调控缺血损伤后凋亡的机制。本研究涉及的主要技术方法有:外周全血及贴壁细胞总RNA的抽提,lnc RNAs芯片,生物信息学分析技术,定量PCR,贴壁细胞培养、传代与OGD模型建立,贴壁细胞转染si RNAs,CCK8细胞活力检测,TUNEL细胞凋亡检测,流式细胞术,Western blotting（蛋白质免疫印迹实验）,医学统计学。第一部分急性脑梗死后循环血lnc RNAs的芯片差异表达谱及生物信息学分析目的:建立急性脑梗死患者与健康志愿者的外周全血lnc RNAs与m RNAs差异表达谱,分析差异表达的lnc RNAs涉及的功能、通路及转录因子。方法:分别采集6例急性脑梗死患者及3例健康志愿者的外周全血,以PAXgene Blood mi RNA Kit提取总RNA,按Agilent Human lnc RNA Microarray 4*180K V5芯片的标准流程进行质控、标记、杂交、扫描、原始信号提取、数据标准化。将p≤0.05,倍数改变值≥2.0者定义为差异lnc RNAs。取倍数改变值排在前400位的lnc RNAs与芯片的完整m RNAs数据库进行共表达分析,然后进行功能预测、通路预测及其与转录因子的关联分析。结果:1、脑梗死患者与健康志愿者对比共检测出差异m RNAs 1990种,其中上调的有1468种,下调的有522种;共检测出差异lnc RNAs 5686种,其中上调的有4641种,下调的有1045种。2、GO分析显示与急性脑梗死差异lnc RNAs相关的m RNAs主要涉及NF-κB转录因子活性的负调控、程序性细胞死亡的正调控等生物功能。3、基于KEGG数据库的Pathway分析显示与急性脑梗死差异lnc RNAs相关的m RNAs主要涉及凋亡、神经营养因子信号通路等。4、与急性脑梗死的差异lnc RNAs相关的m RNAs主要涉及PBX3、STAT1等转录因子。结论:芯片检测可以揭示急性脑梗死的独特全血lnc RNAs表达谱,其探针的阈值可以胜任全血lnc RNAs的检测。其差异m RNAs和lnc RNAs以上调者居多。后续的GO分析显示异常表达的lnc RNAs涉及NF-κB转录因子活性的负调控、程序性细胞死亡的正调控等功能,Pathway分析显示他们与凋亡有密切关系。转录因子关联分析的数据可以促进lnc RNAs转录调节的研究。第二部分循环血lnc RNAs早期诊断急性脑梗死的价值及其与分型、预后的关系目的:1、以定量PCR验证芯片全血lnc RNAs差异表达谱的可靠性;2、进一步探讨lnc RNAs标志物是否是急性脑梗死的独立诊断因子;3、研究lnc RNAs标志物对急性脑梗死的诊断准确性;4、研究lnc RNAs标志物的表达与脑梗死分型及预后的关系。方法:1、选择全血lnc RNAs芯片差异表达谱的部分lnc RNAs,以另外39名急性脑梗死患者及39名健康志愿者的标本以定量PCR检测其表达差异;2、以二分类logistic回归分析来研究差异lnc RNAs与脑梗死状态的相关性;3、使用ROC曲线来判断候选lnc RNAs标志物对急性脑梗死的诊断准确性;4、比较候选lnc RNAs标志物的表达水平在不同OCSP分型的脑梗死患者与健康志愿者之间的差异,比较候选lnc RNAs在3个月随访的MRS高评分组与低评分组之间的差异。结果:1、从芯片差异谱中挑选9种lnc RNAs以定量PCR验证其差异,其中6种lnc RNAs在芯片中是表达增高的;3种在芯片中是表达降低的。定量PCR的结果显示脑梗死患者的这9种lnc RNAs的表达全部都是增高的,其中NR₁20420和lnc-GCH1-2:3有统计差异,其余7种lnc RNAs无统计差异;2、对所有的临床特征、NR₁20420及lnc-GCH1-2:3的表达水平进行logistic回归分析,NR₁20420、年龄及高脂血症进入回归模型,lnc-GCH1-2:3未进入回归模型,NR₁20420有统计学意义;3、NR₁20420诊断完全前循环型（TACI）脑梗死的AUC是0.861,灵敏度和特异度分别是85.7%和84.6%,lnc-GCH1-2:3诊断TACI型脑梗死的AUC是0.802,灵敏度和特异度分别是85.7%和特异度82.1%;4、TACI型脑梗死患者的NR₁20420及lnc-GCH1-2:3表达水平较健康志愿者显著升高,预后不佳组（MRS 3-6）的NR₁20420及lnc-GCH1-2:3表达水平较预后良好组（MRS 0-2）显著升高。结论:定量PCR与芯片的结果总体变化趋势一致,NR₁20420和lnc-GCH1-2:3在脑梗死患者与健康志愿者之间的表达有显著差异。Logistic回归分析显示NR₁20420可作为急性脑梗死的独立诊断因子。这两种lnc RNAs用于诊断脑梗死都具有较高的灵敏度和特异度,二者在外周全血中的表达与脑梗死患者的OCSP分型及预后有相关性。第三部分lnc RNA NR₁20420促进神经细胞缺血损伤后凋亡的机制目的:1、检测来自第二部分研究的两种lnc RNAs在神经细胞的OGD模型中是否发生相应变化,同时选择具体的造模方式及工具si RNAs;2、研究两种目标lnc RNAs是否调控本模型的凋亡;3、研究敲低目标lnc RNAs后模型中靶因子的变化;4、证实敲低目标lncRNAs后模型凋亡的变化与靶因子的变化是否存在因果关系。方法:1、分别以OGD 0、4、8、12h及OGD 4、8、12h后再灌注24h这7种方式处理SH-SY5Y细胞后,以定量PCR检测目标lnc RNAs的变化,分别以设计的6种si RNAs转染细胞后以定量PCR检测相应lnc RNAs的变化;2、对细胞转染敲低效率合格的4种si RNAs后,给予OGD 8h建立细胞模型,再分别以CCK8法检测细胞活力,以TUNEL法及流式细胞术（Annexin V-FITC/PI）检测细胞的凋亡;3、敲低本模型中的NR₁20420后分别以western检测p-P65、P65、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT在蛋白水平的变化;4、对细胞转染si NR₁20420后分别以不加与加PDTC两种方式处理细胞模型后,再分别检测细胞的活力及凋亡。结果:1、两种目标lnc RNAs在本细胞系中经OGD处理后均会表达升高,二者均是在OGD8h后表达最高,然后随OGD时间延长其表达再逐渐下降。二者在OGD4h及8h后的表达都有统计差异。6种si RNAs中si NR₁20420Ⅰ、si NR₁20420Ⅲ、si GCH1-2:3Ⅰ及si GCH1-2:3Ⅱ的敲低效率达到60%以上,后续选择这四种si RNAs作为敲低目标lnc RNAs的工具si RNAs;2、本细胞系造模后细胞活力降低,TUNEL阳性细胞比例增高,流式凋亡细胞比例增高,提示造模在功能层面上是成功的。敲低NR₁20420会升高本模型的细胞活力,会降低TUNEL阳性细胞比例及流式凋亡细胞比例;敲低lnc-GCH1-2:3对本模型的细胞活力、TUNEL阳性细胞比例及流式凋亡细胞比例无明显影响;3、敲低NR₁20420后本模型中的P65、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的蛋白表达无明显变化,p-P65的蛋白表达显著降低;4、转染si NR₁20420Ⅰ和si NR₁20420Ⅲ会升高本模型的细胞活力,会降低TUNEL阳性细胞比例及流式凋亡细胞比例,而PDTC可以取消上述作用。结论:本部分研究选择了较合理可靠的研究设计和lnc RNAs干预工具,NR₁20420与lnc-GCH1-2:3均会在本模型中发生显著变化,但只有敲低NR₁20420对本模型的凋亡有抑制作用。NR₁20420对脑梗死模型是起损害作用的。敲低NR₁20420后本模型中NF-κB（p-P65）的蛋白水平会发生显著降低,NF-κB抑制剂可以取消NR₁20420对本模型中凋亡的调控作用。小结:芯片检测可以揭示急性脑梗死的独特全血lnc RNAs表达谱,后续的GO分析和Pathway分析显示异常表达的lnc RNAs涉及凋亡与NF-κB活性。NR₁20420和lnc-GCH1-2:3在脑梗死患者与健康志愿者之间的表达有显著差异,其中NR₁20420可作为急性脑梗死的独立诊断因子。这两种lnc RNAs用于诊断脑梗死都具有较高的灵敏度和特异度,二者在外周全血中的表达水平与脑梗死OCSP分型及预后有相关性。NR₁20420与lnc-GCH1-2:3均会在神经细胞OGD模型中发生显著变化,但只有敲低NR₁20420对本模型的凋亡有抑制作用。敲低NR₁20420后本模型中NF-κB（p-P65）的蛋白水平会发生显著降低,NF-κB抑制剂可以取消NR₁20420对本模型中凋亡的调控作用。本研究筛选出了两种具有较高诊断价值的脑梗死潜在lnc RNAs生物标志物,初步阐明了NR₁20420在神经细胞缺血损伤后促进凋亡的具体机制,有望提高我国急性脑梗死的诊治水平。