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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起,在猪群中具有高传染性、高致病性和高致死率的特性,严重威胁着世界各国养猪产业的健康发展。近年来,虽然很多猪场已经接种了 PEDV工程疫苗并且提高了饲养管理水平,PEDV的感染率和死亡率有所下降,但是并未真正解决PEDV的侵害。因此,从遗传学角度筛选出PEDV感染有关的关键抗性基因,通过抗病育种的手段,从根本上增强仔猪对PEDV的抗性具有广阔的应用前景。本研究根据课题组前期的评价标准,鉴定出确证的PEDV感染和正常仔猪各4头,选取其空肠组织,使用RNA-seq技术筛选与PEDV感染相关重要的差异表达基因,并在个体水平验证转录组数据的准确性。根据文献挖掘和生物信息学分析,选择生物学功能与PEDV感染密切相关的重要候选基因AQP3基因,从甲基化和启动子区变异的角度,探究其表达调控的分子机制,以期为后续深入研究PEDV感染的遗传调控机制并对其进行抗病育种提供新的依据。主要实验结果如下:1.本研究通过PCR扩增、测序比对和病理切片观察,获得确证的PEDV感染和正常仔猪个体,选择其空肠组织提取组织总RNA进行转录组测序,根据文献挖掘、生物信息学分析和PEDV感染个体及细胞上的蛋白质组学测序结果,筛选与PEDV感染相关的候选基因,并通过RT-qPCR进行验证。结果显示:转录组测序共筛选出290个差异基因,其中PEDV感染组有104个基因表达上调,186个下调。这些差异基因主要富集于趋化因子活性(GO:0008009)、趋化因子受体结合(GO:0042379)和G蛋白偶联受体结合(GO:0001664)3个功能条目以及脂肪消化吸收、趋化因子和新陈代谢等16个信号通路;通过与蛋白质组学结果的比较,结合生物学功能挖掘,共筛选出15个PEDV感染密切相关的候选基因,这些基因在RNA-seq中的表达模式与RT-qPCR中高度一致,说明转录组数据的准确性高。根据生物信息学分析和文献挖掘,将AQP3基因确定为进行下一步功能验证和机制分析的重要候选基因。2.通过RT-qPCR、甲基化测序、ChIP-PCR以及转录因子干扰等试验,初步揭示启动子区甲基化对AQP3基因在PEDV感染过程中的调控作用。结果显示:在腹泻仔猪的小肠中AQP3基因的表达量均出现极显著的下降(P<0.01),且在空肠组织中下降最为明显;PEDV感染仔猪AQP3基因启动子区2个CpG岛的整体甲基化水平均出现升高,但无显著差异,而CpG1的mC-20和CpG2的mC-10甲基化位点与基因表达呈现显著的负相关(P<0.05);ChIP-PCR表明2个与AQP3基因表达水平显著负相关的甲基化位点均与转录因子Sp1存在结合区域,并且在成功构建的Sp1干扰IPEC-J2细胞系中,AQP3基因的表达极显著降低(P<0.05)。上述结果表明,PEDV感染会导致AQP3启动子区CpG1的mC-20和CpG2的mC-10位点甲基化程度提高,抑制Sp1与AQP3启动子的结合,进而降低AQP3基因的表达水平。3.通过PCR扩增、片段分离测序比对、野生型和突变型荧光素酶载体构建、双荧光素酶报告基因和质粒共转染等试验,鉴定AQP3基因启动子存在的插入片段,分析该插入片段对AQP3基因的表达调控作用。结果显示:AQP3基因启动子区-89～-88位点碱基间存在一个长度为16bp的插入片段‘GGGCGGGGTTGCGGGC’,并且该插入片段能极显著提高AQP3基因的启动子区活性(P<0.01);CHIP-PCR证实该插入片段与转录因子C/EBPα存在结合区域,并且pcDNA3.1-C/EBPα质粒与插入片段荧光素酶质粒共转组的荧光素酶活性极显著高于其他组(P<0.01),同样说明该插入片段与转录因子C/EBPα存在相互作用。