长期保存海水养殖病原菌的活性是深入进行其病原学研究的重要前提和保障。真空冷冻干燥技术是目前情况下制备和保藏生物材料最有效的方法之一。本文初步探讨了真空冷冻干燥技术在5株海水养殖重要致病菌菌种保藏中的应用，相关的研究成果将为海洋细菌真空冷冻干燥工艺研究提供重要的参考和借鉴。1.病原微生物冷冻干燥保护剂的筛选实验选取迟钝爱德华氏菌、假交替单胞菌、哈维氏弧菌、灿烂弧菌、鳗弧菌等5株3属的病原细菌为实验菌株，以不同浓度的脱脂乳、海藻糖、甘露醇、乳糖、果糖、葡萄糖、抗坏血酸和明胶等八种物质作为冻干保护剂，以添加等体积1.50%氯化钠溶液为对照。结果表明：以不同浓度的抗坏血酸和明胶为冻干保护剂的实验组中均未检测到活菌的存在；与对照组相比，一定浓度的脱脂乳和糖类均可在冷冻干燥过程中对病原菌起到保护作用，各保护剂对菌株的冻干保护效果由强到弱依次为：假交替单胞菌：脱脂乳，麦芽糖，海藻糖，乳糖，甘露醇，葡萄糖，果糖；迟钝爱德华菌：脱脂乳，乳糖，甘露醇，海藻糖，麦芽糖，葡萄糖，果糖；哈维氏弧菌：甘露醇，海藻糖，乳糖，麦芽糖，果糖，脱脂乳，葡萄糖；鳗弧菌：乳糖，甘露醇，脱脂乳，麦芽糖，海藻糖，葡萄糖，果糖；灿烂弧菌：甘露醇，乳糖，脱脂乳，海藻糖。2.冷冻干燥保护剂配伍优化根据单因素筛选的实验结果，本章选取脱脂乳、乳糖、海藻糖和甘露醇为冻干保护剂，同时添加了一定量的抗坏血酸作为抗氧化剂，明胶作为赋形剂来进行保护剂的正交复配实验。结果表明，假交替单胞菌、迟钝爱德华氏菌和哈维氏弧菌通过正交分析得到了最佳的保护剂配比，并且通过三次重复验证实验可证明复配保护剂的稳定性较好。其中假交替单胞菌的最佳保护剂配比和对应的细胞存活率为：乳糖7.5%、甘露醇5%、海藻糖5%、脱脂乳10%、Vc0.5%、明胶0.5%，3次重复检验细胞存活率均大于32.17%；迟钝爱德华氏菌为：5%的乳糖、15%的脱脂乳、0.5%明胶、0.5%的Vc，3次验证后保护剂的稳定性较好，细胞存活率在20.0%左右。哈维氏弧菌的最佳保护剂配比为：7.5%的乳糖、5%的甘露醇、5%的海藻糖、15%的脱脂乳、0.5%的明胶和0.5%的Vc，验证实验中细胞存活率均在5.0%左右。鳗弧菌和灿烂弧菌因冻干后的细胞复活率极低，各正交实验组之间差异不明显，未获得保护效果明显的保护剂配比。上述结果表明弧菌类的菌株与假交替单胞菌和迟钝爱德华氏菌相比，其冻干保护效果较差。3.真空冷冻干燥条件与工艺优化以假交替单胞菌为代表菌株，以经复配并验证的假交替单胞菌复配保护剂为冻干保护剂，主要对冻干保存过程中保护剂含盐量，复水介质，初始细菌浓度，保护剂与菌液的比例，细菌生长阶段等工艺条件进行探讨。结果表明：当以1.5%NaCl溶液制备菌悬液时，保护剂的最佳含盐量为0.5%，此时细菌的存活率为40.3%；初始细胞浓度的最适范围在1-5×109CFU/ml之间，细胞浓度过高或过低都会降低细胞存活率；5-10%脱脂乳溶液的复水效果最佳，灭菌海水的复水效果最差；当菌液与保护剂的体积比分别为1:1,1:2,1:3时，细菌存活率依次为35.95%，37.14%，37.15%，表明过高浓度的保护剂对细菌存活率没有显著影响；相比对数生长期，生长稳定期的假交替单胞菌冻干后细菌保护效果更佳。4.细菌冷冻干燥保存方法与超低温保藏方法的比较研究本章中着重对-80℃超低温保藏技术和冷冻干燥保藏技术进行比较。结果表明，通过超低温保藏的迟钝爱德华氏菌和假交替单胞菌细胞存活率呈持续下降趋势，在接下来的半年内由100%降至30%左右。通过冷冻干燥技术保藏的迟钝爱德华氏菌由冻干后的初始存活率19.83%降至17.44%；假交替单胞菌的细胞存活率由最初的33.57%降至31.22%。由此可知，相较超低温保藏技术而言，冷冻干燥技术在海水养殖病原菌菌种长期保存过程中的稳定性较好，但由于真空冷冻干燥技术操作繁琐，冻干前后细菌存活率下降幅度较大，菌粉只能复活一次。因此，短期保存与需多次复活的病原菌以超低温保藏技术保藏效果较好。本研究对5株海水养殖病原菌冷冻干燥保护剂进行了筛选与复配，同时以假交替单胞菌为实验菌株，对冷冻干燥过程中部分工艺条件进行探讨。并且对-80℃超低温保藏技术和冷冻干燥保藏技术进行比较。冷冻干燥保护剂的筛选与复配以及冻干条件的优化使得冷冻干燥技术更好的应用于海水养殖病原菌菌种保藏方面，这将为海水养殖病原菌的病原学研究提供强有力的支撑。