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甘蔗杆状病毒(Sugarcane Bacilliform virus,SCBV)是侵染甘蔗的重要病毒之一,目前在全球主要甘蔗种植区均有发生,并造成甘蔗部分品种产量下降。本论文通过对SCBV在国内的发生情况进行相关探讨,试图建立灵敏、准确的病害鉴定和检测方法,从而制定病害防治对策和指导甘蔗的育种工作,并为进一步开发利用SCBV启动子及加深对拟逆转录病毒(Pararetrovirus,PRVs)的认识打下基础。
从广西甘蔗植株叶片抽提总DNA,通过分段PER扩增及克隆测序,获得了甘蔗中含有的全长为5364bp的环状核苷酸序列,暂命名为SCBV疑似序列(SCBV-YS)。通过与GenBank上登录的SCBV-IM序列进行比对分析,发现SCBV-YS有两处核苷酸序列缺失,分别在第2480bp-2655bp间以175bp置换了1170bp,缺失995bp及第5204bp-5209bp间以4bp置换了1324bp,缺失1320bp,两处合计缺失2.3kb。序列缺失使SCBV-YS只含有2个完整的开放阅读框(ORF),分别为ORF1、ORF2。 SCBV-YS ORF1及ORF2的结构和大小与已报道的SCBV-IM、SCBV-M及其它Badnavirus基本一致,推测编码的蛋白大小分别为21.52kD及13.25kD。虽然没有完整的ORF3,但将SCBV-YS放于GenBank中进行序列分析,发现它具有正常的ORF3起始密码子(位于SCBV-YS第1543nt-1546nt处的ATG)及其后的几百个ORF序列,但接着有一段与SCBV及其他Badnavirus没有同源性的序列,即第2480bp.2655bp间的175bp。因为这175bp不相关序列的出现使ORF3提前遇到终止密码子而终结,但是如果采用+1移码的方式,SCBV-YS序列还是能推导产生与SCBV及Badnavirus其他成员ORF3编码的多聚蛋白高度一致的保守氨基酸基序,分别为天冬氨酸蛋白酶(Aspartic ptotease,AP)、反转录酶(Reverse transcriptase,RT)、运动蛋白区(Movement protein dommn,MP)、富含半光氨酸的锌指状的RNA结合区(Cysteine-rich zinc finger-like RNA-binding region,RB)、第二个富含半光氨酸区(Second cystein-rich region,2nd CR)。但由于5204bp-5209bp间以4bp置换了1324bp,使得SCBV-YS缺失了病毒复制相关的保守基序RNA酶H(RNase H,RH)。
将SCBV-YS核苷酸序列全长及2个完整的ORFs推导的氨基酸序列在GvnBank中进行BLAST分析,搜索结果表明其与Badnavirus病毒基因组相应序列高度同源。进化树分析亦说明无论在核苷酸水平或是氨基酸水平上,SCBV-YS均与SCBV-IM及SCBV-M形成一个分支,表明它们间亲缘关系最近。
Southern杂交实验初步证明SCBV-YS是整合入甘蔗基因组中的SCBV基因片段,但整合的拷贝数及整合机制还有待进一步研究。
本研究还探讨了从富含大量酚类及多糖等有机物质的蔗叶中提取DNA,发现2%CTAB法及硅胶膜基因组DNA法能获取较高质量的DNA,适合用于PCR检测。
此外,本文对已知DNA旁侧序列获取技术进行了探索和优化,为今后深入研究打下基础。