【摘 要】
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目的:克隆少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因并进行突变分析,同时构建eda-A1基因编码序列(CDS)突变型(M)和野生型(W)的真核表达载体pcDNA3.1(-)-eda-A1-M/W,转染脐静脉内皮细胞(ECV),观
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目的:克隆少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因并进行突变分析,同时构建eda-A1基因编码序列(CDS)突变型(M)和野生型(W)的真核表达载体pcDNA3.1(-)-eda-A1-M/W,转染脐静脉内皮细胞(ECV),观察细胞周期的变化,以进行eda基因功能研究。方法:设计含有BamH I和HindⅢ的酶切位点的引物,从HED患者和正常对照者外周血淋巴细胞中提取总mRNA,利用RT-PCR法克隆eda-A1(M/W)基因cDNA序列;运用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pcDNA3.1(-)载体和eda-A1(M/W)基因片段,将eda-A1(M/W)插入到pcDNA3.1(-)载体中,从而构建新的真核表达载体,命名为pcDNA3.1(-)-eda-A1-M和pcDNA3.1(-)-eda-A1-W,重组载体PCR、双酶切、DNA测序分析;重组载体转染人脐静脉内皮细胞(ECV),进行eda基因超表达,以分析eda基因对细胞功能的影响。结果:克隆少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因并发现未见报道过的907位A→C(A907C)错义突变,导致306位编码氨基酸由谷氨酰胺变异为脯氨酸(Gln306→Pro);经PCR、双酶切验证,成功构建了pcDNA3.1(-)-eda-A1-W/M的真核表达载体;流式细胞术结果显示:1)与空质粒组(对照组,C)组相比,野生型(Wlid,W)组S细胞增多,G2/M期细胞明显减少(P<0.01);突变体(Mutant,M)组中有更多细胞进入G0/G1期,而S期、G2/M期细胞明显减少(P<0.01);2)与野生型组相比,突变体组中G0/G1期细胞增加,S期细胞减少(P<0.01)。结论:野生型eda基因对细胞周期具有一定得影响,可能参与DNA合成过程;由于G0/G1期细胞比例升高,推测eda基因突变体对细胞增殖有一定的促进作用;突变体和野生型eda基因有明显不同的分子生物学功能。此研究为进一步探索该基因在牙齿发育中的生物学作用奠定了实验基础。
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