论文部分内容阅读
目的： 本实验利用乳腺癌体外细胞模型，探讨短发夹RNA（shRNA）介导的己糖激酶2（hexokinase2, HK2）基因沉默是否对乳腺癌细胞的放疗敏感性和放疗效果有影响。通过慢病毒介导的RNA干扰技术构建己糖激酶-2（HK2）低表达的稳定的乳腺癌MDA-MB231细胞株，然后利用构建的稳定细胞株观察利用shRNA干扰技术使HK2基因表达水平降低与乳腺癌细胞MDA-MB231放射治疗敏感性之间的关系。 方法： 利用慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）干扰技术设计3个沉默HK2的shRNA基因序列（h-HK2 shRNA1、h-HK2 shRNA2、h-HK2 shRNA3）以及一个阴性对照序列(Negative shRNA)，将3沉默序列及一个阴性对照序列分别与质粒连接，然后转染人293T细胞，将靶基因植入慢病毒载体，随后转染乳腺癌MDA-MB231细胞系，通过抗生素嘌呤霉素筛选获得HK2低表达的乳腺癌MDA-MB231细胞系。采用RT-PCR及western blotting方法分别从mRNA和蛋白水平检测转染后的沉默效果。筛选出沉默效果最佳的稳定细胞株用于后续实验，后续实验分为3组：空白组（Control组，即不做任何处理），阴性对照组（Negative组，即转染阴性质粒组）以及沉默的实验组（HK2 shRNA组，即转染稳定沉默HK2基因质粒的实验组）。 1、将上述三组不同的细胞分别置于0、2、4、6、8Gy剂量的X线下照射，通过CCK-8实验观察三组细胞在上述不同剂量下的细胞增值情况。 2、将上述三组细胞在6Gy剂量的X线下照射，然后利用流式细胞术（FCM）检测三组细胞在6 Gy X线照射下细胞的凋亡情况。以此来判断沉默HK2与乳腺癌细胞MDA-MB231放射治疗敏感性之间的关系。 结果： 1、成功构建带有沉默HK2基因序列pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro的质粒。 2、RT-PCR及 western blot结果显示：三个沉默 HK2的序列中，h-HK2-shRNA1基因序列沉默的效果最好，沉默后HK2的mRNA相对表达量下降了89%。 3、三组细胞分别在0、2、4、6、8Gy的 X线照射后，三组细胞的存活率在同一个剂量下h-HK2-shRNA1组要明显低于Control组和Negative组(P<0.05)；并且，随着照射剂量的逐渐增高，三组细胞的存活率也逐渐下降，且 h-HK2-shRNA1组下降的幅度更大。 4、流式细胞术结果显示：三组细胞在6Gy的X线照射下，凋亡率分别为Control组（29.1%），Negative组（29.4%）和 h-HK2-shRNA1组（59.9%），可以看出h-HK2-shRNA1组的细胞凋亡率明显高于其余两组，且P<0.05。 结论： 利用慢病毒介导的RNA干扰技术有效的降低的乳腺癌细胞中HK2的表达水平，并成功的构建了带有沉默HK2基因序列的质粒，进而感染乳腺癌MDA-MB231细胞株，得到稳定转染HK2的乳腺癌细胞株。通过放射治疗后，沉默细胞组增值率明显下降，凋亡率明显升高，说明 HK2与乳腺癌的放疗敏感性有关，沉默 HK2可增加乳腺癌对放射治疗的敏感性。